第一部分瓜氨酸对脓毒症大鼠肝损伤及Cit-NO循环的影响背景与目的:临床调查发现,脓毒症时血浆及肌肉中的精氨酸(Arg)水平明显下降,然而对脓毒症患者直接补充外源性精氨酸并不能改善脓毒症的病情发展。瓜氨酸(Cit)可以通过“瓜氨酸—一氧化氮循环”(Cit-NO cycle)参与精氨酸的体内代谢。并且肝脏是参与Cit-NO循环的重要器官之一,同时也是脓毒症发生发展中最容易受到损伤的器官之一。因此,本研究探讨补充外源性瓜氨酸对脓毒症大鼠肝损伤以及Cit-NO循环的影响。方法:本研究采用最经典的盲肠结扎穿孔(CLP)脓毒症大鼠模型,将大鼠分为正常组(Normal group),假手术组(sham group),瓜氨酸组(Cit group),生理盐水组(NS group),CLP模型组(CLP group)以及CLP模型加瓜氨酸组(CLP+Cit group)。再根据CLP造模后大鼠被处死的时间点,CLP组和CLP+Cit组又各自分出6h,12h,24h,48h四个时间点亚组。Cit组和CLP+Cit组大鼠术前给予瓜氨酸连续灌胃给药7天,剂量为200mg/d。术后每6小时观察各组大鼠一般状况及生存情况,在预定时间点处死各组大鼠,收集大鼠血液及肝脏组织样本。取大鼠血液使用生化检测仪检测大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。取肝脏组织做HE染色观察病理变化情况,利用检测试剂盒分别测量大鼠肝脏组织超氧化物歧化酶(SOD)的活力、丙二醛(MDA)的含量、NO的含量以及诱导型一氧化氮合酶(i NOS)的活力。运用高效液相色谱—串联质谱法(HPLC-MS/MS)检测大鼠血浆中Cit和Arg含量。所有相关数据的统计分析利用SPSS 16.0统计软件进行,设定P<0.05为存在统计学差异。结果:Sham group,Cit group和NS group存活率均为100%(8/8)。CLP group术后6h,12h,24h,48h四个时间点亚组相对应的存活率分别为:75%(9/12),50%(8/16),33.33%(8/24)和6.25%(2/32)。CLP+Cit group术后6h,12h,24h,48h四个时间点亚组相对应的存活率分别为:83.33%(10/12),68.75%(11/16),66.67%(16/24)和25%(8/32)。CLP+Cit 24h和48h亚组大鼠的生存率均显著高于相对应的CLP 24h和48h亚组大鼠(both P<0.05)。HE染色结果显示所有CLP组和CLP+Cit组大鼠肝脏均出现不同程度的肝损伤相关病理改变。此外,实验结果显示CLP+Cit 12h和24h亚组大鼠血清AST水平显著低于CLP 12h和24h亚组(both P<0.05)。在CLP术后6h,12h,24h三个时间点,CLP+Cit各组大鼠肝脏SOD活力值都显著高于CLP各组(all P<0.05)。然而,CLP+Cit各组大鼠肝脏MDA水平都低于CLP各组,其中CLP+Cit 12h和24h亚组大鼠肝脏MDA水平显著低于CLP 12h和24h亚组(both P<0.01)。另外,在CLP术后6h,12h,24h三个时间点,CLP各组大鼠肝脏NO水平都显著高于CLP+Cit各组(all P<0.05)。同时,i NOS活力在CLP+Cit各组中都低于CLP各组,但比较不存在统计学差异(all P>0.05)。在术后24h内,CLP组大鼠血浆Arg水平随着时间变化呈下降趋势,并且CLP 24h亚组大鼠血浆Arg含量显著低于正常组(P<0.01)。此外,CLP+Cit组大鼠血浆Arg浓度明显高于CLP组(P<0.05)。CLP术后24h内,CLP+Cit组大鼠血浆Arg水平改变不显著,CLP+Cit 24h亚组大鼠血浆Arg含量接近基线水平(Cit group)。结论:补充外源性瓜氨酸可以改善脓毒症大鼠的生存情况,提高存活率。补充外源性瓜氨酸可以使得脓毒症大鼠肝组织SOD活力升高,提高脓毒症大鼠肝脏抗氧化的能力,对肝脏具有保护作用。补充外源性瓜氨酸可以降低脓毒症早期大鼠肝脏中MDA水平,减轻肝脏受损伤程度。外源性瓜氨酸可以减少脓毒症时NO的生成,提高血浆Arg含量并且使之维持在基线水平。第二部分瓜氨酸对脓毒症早期细胞因子表达的影响背景与目的:细胞因子在脓毒症的发生发展中扮演着十分重要的角色。脓毒症早期,机体处于促炎阶段,此时体内产生大量的促炎细胞因子,主要包括IL-1、IL-6、TNF-α等。这些促炎细胞因子的释放,激活机体先天性或者适应性免疫应答,进一步诱导其它细胞因子或炎症介质释放,引起“细胞因子风暴”,是造成肝损伤的重要因素。前期研究发现外源性瓜氨酸可以降低脓毒症大鼠促炎因子IL-6的表达,被视为一种安全的免疫调节途径。因此,本部分研究在前期研究的基础上,进一步全面探讨外源性瓜氨酸对脓毒症早期主要细胞因子表达的影响。方法:利用CLP脓毒症大鼠模型,将大鼠分为正常组(Normal group),瓜氨酸组(Cit group),CLP模型组(CLP group)以及CLP模型加瓜氨酸组(CLP+Cit group)。根据造模后大鼠被处死的时间点,CLP组和CLP+Cit组又各自分出6h,12h,24h三个时间点亚组。利用Luminex悬浮液态芯片技术对各组大鼠血清中细胞因子的浓度进行检测,总共包括27种细胞因子和趋化因子:EGF,Eotaxin,Fractalkine,G-CSF,GM-CSF,GRO/KC/CINC-1,IFN-γ,IL-1α,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,IL-12(p70),IL-13,IL-17A,IL-18,IP-10,Leptin,LIX,MCP-1,MIP-1α,MIP-2,RANTES,TNF-α和VEGF。结果:悬浮液态芯片检测细胞因子得到的标准曲线以及质控参数结果均满意。细胞因子浓度结果显示,CLP 6h亚组大鼠血清中所有检测的27种细胞因子浓度都高于正常组,其中21种细胞因子的浓度比较存在统计学差异(P<0.05)。其余6种细胞因子IL-13,Fractalkine,LIX,IL-18,VEGF,IL-12(p70)在CLP 6h亚组中的浓度同样高于正常组,但不存在统计学差异。在CLP造模后24h内,总共检测的27种细胞因子中,20种细胞因子的血清浓度水平达到峰值的时间点在CLP+Cit group中晚于CLP group,包括EGF,Eotaxin,G-CSF,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,IL-12(p70),IFN-γ,IL-17,Leptin,MCP-1,MIP-1α,MIP-2,TNF-α,VEGF,IL-13和Fractalkine。只有2种细胞因子GM-CSF和IP-10的浓度峰值在CLP+Cit group中出现得早于CLP group。此外在CLP术后6h时,促炎细胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6在CLP6h亚组大鼠血清中的浓度明显高于CLP+Cit 6h亚组(all P<0.05)。而在造模后24h时间点上,主要的抗炎因子IL-4和IL-10在CLP+Cit 24h亚组大鼠血清中的浓度比CLP 24h亚组高出5倍左右,其中血清IL-4的比较存在统计学差异(P<0.05)结论:芯片结果表明我们实验中CLP脓毒症大鼠模型建立效果满意。补充外源性瓜氨酸可以延缓脓毒症早期体内细胞因子和趋化因子的释放。补充外源性瓜氨酸使得脓毒症早期机体的“促炎状态”得到缓解,减少促炎细胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6的大量释放。外源性瓜氨酸使得抗炎细胞因子IL-4和IL-10的释放延迟。第三部分瓜氨酸对脓毒症大鼠STAT1/STAT3信号通路的影响背景与目的:JAK/STAT信号通路是多种炎症细胞因子的共同信号通路,在脓毒症中发挥着举足轻重的作用。其中STAT1和STAT3在脓毒症中相关作用的研究报道尤为突出,被认为是与脓毒症关系最为密切的STAT家族成员,参与许多炎症因子的信号传导过程。本部分研究在前一部分研究的基础上,探讨补充外源性瓜氨酸对脓毒症大鼠STAT1/STAT3信号通路的影响。方法:利用CLP脓毒症大鼠模型,将大鼠分为CLP模型组(CLP group)以及CLP模型加瓜氨酸组(CLP+Cit group)。根据造模后大鼠被处死的时间点,CLP group和CLP+Cit group又各自分出6h,12h,24h三个时间点亚组。利用实时荧光定量PCR技术检测CLP group和CLP+Cit group大鼠造模术后6h,12h,24h三个时间点肝脏组织中STAT1和STAT3的m RNA表达水平。利用免疫印迹方法检测CLP group和CLP+Cit group大鼠肝脏组织中STAT1和STAT3的蛋白表达水平以及磷酸化水平。结果:在术后6h,12h,24h三个时间点,STAT1和STAT3 m RNA相对表达量在CLP group和CLP+Cit group之间都不存在显著统计学差异(P>0.05)。同样在这三个时间点上,CLP group和CLP+Cit group大鼠肝脏组织中STAT1和STAT3蛋白表达水平也不存在统计学差异(P>0.05)。但是,CLP+Cit 6h和12h亚组大鼠肝脏组织STAT1和STAT3的磷酸化水平则明显低于CLP 6h和12h亚组(P<0.05)。结论:在CLP诱导的脓毒症大鼠中,补充外源性瓜氨酸不影响STAT1和STAT3的m RNA水平及蛋白表达水平,但是可以下调脓毒症早期STAT1和STAT3蛋白的磷酸化水平。