论文部分内容阅读
水产养殖为世界提供了将近三分之一的食物,其中软体动物养殖产量在全球水产养殖中居第二位,80%-90%来自中国和日本。栉孔扇贝和海湾扇贝是中国重要的养殖品种,但是在过去的几十年间,由于频繁爆发的疾病使中国的扇贝养殖业遭受了巨大的经济损失,因此有必要通过分子手段加快抗病品种的培育步伐。标记辅助育种(marker assisted selection,MAS)是成功应用于动物育种中的分子手段之一,但由于缺乏与抗病性状相关的标记,MAS目前还无法在软体动物中得到应用。因此,寻找与抗病性状相关的分子标记是在软体动物中发展MAS的关键。
本研究利用鳗弧菌(Listonella anguillarum)对栉孔扇贝和海湾扇贝进行攻毒感染实验,初步得到敏感群体和抗病群体后采用PCR、PCR-RFLP和Tetra ARMs PCR等方法研究了CfPGRP、CfLGBP、AiSPI和AiDef基因多态性及其与扇贝对鳗弧菌抗性/敏感性的关系。
肽聚糖识别蛋白(PGRP)和脂多糖和β-1,3-葡聚糖结合蛋白(CfLGBP)作为模式识别受体,在固有免疫中发挥重要作用。本研究对栉孔扇贝CfPGRP和CfLGBP的基因多态性及其与扇贝对鳗弧菌的抗性进行了关联分析。在CfLGBP和CfPGRP基因中分别发现8个和12个多态性位点,其中CfLGBP的脂多糖和葡聚糖结合蛋白基序中有两个非同义突变(+4407位点和+4408位点),而在CfPGRP的肽聚糖识别蛋白结合基序中有一个非同义突变(+7679)。这三个位点在抗病群体和敏感群体中的分布存在显著性差异(P<0.05),CfPGRP基因的+4407 CT基因型和+4408 G/A基因型,CfLGBP基因的+7679 G/G基因型与栉孔扇贝对鳗弧菌的抗性相关。为了验证这个结果,利用酶联免疫吸附实验分别检测了LPS,PGN和β-glucan与不同基因型的PGRP和LGBP蛋白间的结合活性。结果表明,两种基因型的蛋白与相应配体的结合活性具有显著性差异(P<0.05)。另外检测了不同基因型的PGRP的抗菌活性,尽管两种基因型的PGRP都能抑制大肠杆菌的生长,但两种之间无显著性差异(P>0.05)。总之,CfPGRP基因的+4407 CT基因型和+4408 G/A基因型,CfLGBP基因的+7679 G/G基因型与栉孔扇贝对鳗弧菌的抗性相关。CfPGRP和CfLGBP基因多态影响了病原相关分子模式的结合活性,但并没有影响抗菌活性。这些结果表明这3个位点可以作为潜在的分子标记应用于扇贝抗病育种中。
同时,我们检测了AiSPI和AiDef基因部分序列的多态性,并对其与抗病性的关系进行了探讨。在AiSPI基因中找到9处SNPs位点,其中5处为非同义突变;在获得的AiDef基因部分序列中没有发现多态性位点。选取AiSPI基因的两处多态性位点,+536和+1312进行抗病相关性分析。结果表明+536 A-G多态性位点与扇贝对鳗弧菌的抗性/敏感性显著相关,+536 A/A基因型在抗病群体中的分布显著高于敏感群体(P<0.05);而+1312 C-T位点与与扇贝对鳗弧菌的抗性/敏感性不相关(P>0.05)。具有+536 A/A基因型的AiSPI基因编码的蛋白,rAiSPI(N)具有较强的体外丝氨酸蛋白酶活性(P<0.05)。但这个结果仍需要进一步的体内实验来证实。这些结果(将)为贝类的标记辅助育种提供参考。此外,抗病相关分子标记的发现还有利于加深对扇贝发病机理的理解,并有助于发掘预防及治疗贝类疾病的新方法。