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研究背景：糖尿病是一种严重危害人类健康的代谢性疾病。1型糖尿病在儿童青少年时期常见，胰岛素替代疗法是1型糖尿病的经典治疗方法。由于胰岛素治疗不能完全控制1型糖尿病的代谢紊乱，不能有效地预防和阻止糖尿病视网膜病变，肾脏、神经、大血管和微血管并发症的发生，近年来，通过在体内重建内源性胰岛素分泌系统从根本上治愈糖尿病已逐渐成为共识。胰岛移植作为在体内重建内源性胰岛素分泌系统最安全、有效的方法之一，不仅可以纠正糖代谢紊乱，还可以防止、减缓甚至逆转糖尿病并发症发生，在2000年Edmonton方案问世以来更是受到了前所未有的关注。但异体胰岛移植物进入受者体内后，由于免疫排斥和细胞凋亡使胰岛移植物功能丧失，影响移植效果，这是目前胰岛移植亟待解决的问题之一。胰岛细胞凋亡是胰岛移植物被破坏和功能丧失的重要机制。对胰岛移植物进行遗传修饰，使其表达A20、HO-1等对细胞具有保护性的基因，或许能够保护移植物免受凋亡，延长其在体内的存活，提高胰岛移植的成功率。目的：1、在胆管内胶原酶灌注分离SD大鼠胰岛的基础上，探索一种省时、经济、高质量的胰岛纯化方法。2、建立人A20、HO-1基因的慢病毒转染系统以及转染SD大鼠胰岛的技术。3、检测人A20、HO-1基因在转染胰岛细胞中的表达情况以及A20、HO-1蛋白对体外培养的胰岛活性的影响。4、观察A20、HO-1蛋白拮抗CHX+TNF-α诱导的胰岛细胞凋亡作用，并初步探讨其作用机制。方法：1、采用胆总管内灌注胶原酶的方法消化、分离胰岛，分别以基于Ficoll的不连续“密度梯度离心法”和两次经不同孔径滤网(600μm和70μm)过滤弃杂纯化的“两次过筛法”纯化胰岛，采用DTZ染色、AO／PI双色荧光染色法鉴定分离胰岛的质量，并对两种纯化方法的结果进行比较。2、分组：转A20组，转HO-1组，共转A20、HO-1组，转EGFP组，空白对照组，空白诱导(凋亡)组，共六组。3、分别以低糖(2.8mM)和高糖(28mM)无血清RPMI 1640培养液作胰岛素释放试验，计算刺激指数(SI)，测定胰岛细胞胰岛素分泌功能。用免疫组化检测胰岛素，观察胰岛素合成功能。4、克隆基因、构建A20、HO-1和EGFP转移载体，并制备慢病毒颗粒，利用慢病毒系统转染体外培养的胰岛(MOI=100)。通过荧光显微镜连续观察EGFP的表达情况来评估转基因效率及确定诱导凋亡时机。用Western blot测定A20和HO-1蛋白的表达情况。5、收集培养液，用大鼠超敏胰岛素ELISA试剂盒检测培养液上清中的胰岛素浓度。6、凋亡检测：培养96h的胰岛经CHX(50μg／ml)预处理2h后加TNF-α(5000U／ml)处理48h进行凋亡检测。①TUNEL和Hoechst33258荧光共定位染色、IPP专业图像分析软件计数并计算凋亡率；②流式细胞仪检测：胰岛经0.25％胰酶短暂消化并吹打成单细胞后，用Annexin V／PI双染色，经流式细胞仪检测凋亡情况；③Western blot检测caspase-3的活化。结果：1、密度梯度离心法胰岛收获量为598±135胰岛／大鼠，胰岛纯度在65～85％，活率在85～95％；两次过筛法胰岛收获量为782±115胰岛／大鼠，胰岛纯度在90～100％，活率大于95％。利用两次过筛法纯化，胰岛收获量显著多于密度梯度离心法胰岛收获量(P＜0.01)。2、刚分离的胰岛细胞，在低糖和高糖刺激下，体外培养液中胰岛素浓度分别为：22.15±1.77μg／L和49.35±3.88μg／L，刺激指数为2.23±0.05；培养24小时的胰岛细胞，在低糖和高糖刺激下，体外培养液中胰岛素浓度分别为：26.12±4.20μg／L和76.88±6.14μg／L，SI为2.99±0.37。3、随着时间的推移，体外培养的胰岛合成胰岛素的能力逐步下降。4、A20和HO-1基因通过慢病毒系统可在原代胰岛细胞中高效表达。5、体外培养48h和96h，转基因各组培养液上清胰岛素浓度高于空白对照组(P＜0.01)6、TUNEL检测凋亡结果显示单独或共转染A20、HO-1基因能有效阻止由CHX和TNF-α诱导的胰岛细胞的凋亡(A20+TNF-α、HO-1+TNF-α、A20+HO-1+TNF-α组VSC+TNF-α组，P＜0.01)，流式细胞仪检测的结果和TUNEL的结果相吻合。7、Western blot结果显示TNF-α在体外诱导胰岛细胞的凋亡通过caspase-3途径，A20和HO-1蛋白可以通过抑制caspase-3的激活来拮抗TNF-α诱导的细胞凋亡。成本、获得高质量的胰岛。该方法在啮齿类动物胰岛纯化中值得推广。2、本研究证实慢病毒作为转基因的载体，具有高效的基因转移、稳定的基因表达的特点，慢病毒可用作胰岛转基因的载体。3、本研究证实在原代胰岛细胞中高效表达的A20、HO-1蛋白具有抗CHX+TNF-α诱导的胰岛凋亡，发现共转A20、HO-1基因有协同的抗凋亡效应。为临床胰岛移植延长移植物生存时间、保护其功能提供理论依据。