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目的:本文以中等极性大孔树脂HPD 750及环氧树脂LX-120作为载体,以新型环氧试剂聚乙二醇二缩水甘油醚(poly(ethylene glycol)diglycidyl ether)做交联剂,制备两种固定化脂肪酶,以探究这两种树脂及该交联剂生产工业用固定化酶的应用价值。方法:(1)通过比较固定化酶酶活力及酶活回收率,确定合适的大孔树脂及环氧树脂作为载体。(2)通过比较固定化酶酶活力,确定合适的吸附—交联固定化的交联剂。(3)通过比较固定化酶酶活力,确定吸附固定化的温度、p H、给酶量以及交联固定化最佳的温度、时间及交联剂浓度,设计Plackett-Burman试验和响应面试验优化得最佳条件。(4)通过比较固定化酶酶活力,确定环氧树脂共价固定化最佳温度、时间、p H及给酶量,响应面试验优化得最佳条件。(5)通过比较固定化酶酶活力,探究所制备的固定化酶的热稳定性、酸碱稳定性、操作稳定性及储存稳定性。结果:(1)脂肪酶吸附-交联固定化最佳载体为苯乙烯型中极性大孔树脂HPD 750;最佳交联剂为新型环氧交联剂聚乙二醇二缩水甘油醚;脂肪酶共价结合固定化最佳载体为新型国产环氧树脂LX-120。(2)响应面试验优化大孔树脂吸附-交联固定化条件为:吸附时间8 h,吸附温度45℃,给酶量60 mg/g,交联温度30℃,交联时间12.5 h,p H为6.36,交联剂体积浓度为0.7%。(3)响应面试验优化所得环氧树脂共价结合固定化条件为:给酶量为18.5 mg/g,反应温度为26℃,p H为6.27,反应时间为2 h。(4)按优化条件制备的大孔树脂吸附-交联固定化酶酶活力为565.31 U/g,此时固定化酶酶活力回收率为32.16%;按优化条件制备的环氧树脂共价结合固定化酶酶活力为544.28 U/g,此时固定化酶酶活力回收率为73.67%。(5)大孔树脂吸附—交联固定化酶及游离酶的最适反应温度均为60℃。温度由60℃升高至100℃时,两者酶活力均下降,但是游离酶酶活力下降较快。100℃时,固定化酶活力仍保留71.2%以上,而游离酶活力仅为60℃时的38.75%;60℃保温7 h,固定化酶活力保留约72.94%,而游离酶活力保留55.47%。在p H 5到8的环境中,固定化酶的酶活保留率均高于游离酶。连续操作10次,固定化酶活力保留34.86%。4℃储存30 d,固定化酶活力保留64.81%。综上所述,相较于游离酶,制备得的固定化酶热稳定性和酸碱稳定性都有提升,且具有较好的操作稳定性和储存稳定性。(6)环氧树脂共价固定化酶及游离酶的最适反应温度均为60℃。60℃保温7 h,固定化酶活力保留约66.21%,而游离酶活力保留55.47%。在p H 5到10的环境中,固定化酶的酶活保留率均明显高于游离酶。连续操作10次,固定化酶活力保留64.21%。4℃储存30 d,固定化酶活力保留78.14%。综上所述,相较于游离酶,制备得的共价固定化酶热稳定性和酸碱稳定性都有提升,且具有良好的操作稳定性和储存稳定性。结论:(1)国产大孔树脂HPD 750及环氧树脂LX-120均可作为脂肪酶固定化的载体;(2)聚乙二醇二缩水甘油醚可作为脂肪酶交联固定化的交联剂;(3)成功制备了吸附-交联固定化和共价结合固定化脂肪酶;(4)环氧树脂共价结合固定化酶较大孔树脂吸附-交联固定化酶具有更好的酸碱稳定性、操作稳定性及储存稳定性。