章鱼肠道产蛋白酶菌的分离鉴定及酶学特性研究

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采用水解透明圈和检测蛋白酶活力的方法,从章鱼肠道中分离出一株产蛋白酶的菌株,对菌株进行了形态观察、生理生化实验和16SrRNA全序列鉴定。研究了菌株的最适发酵条件,考察了碳源、氮源、发酵时间、发酵温度、起始pH值等因素对菌株产蛋白酶的影响。同时利用硫酸铵沉淀、离子交换层析等方法分离纯化出一种电泳级蛋白酶纯品,并对其酶学特性进行了研究。考察了蛋白酶的分子量、最适作用温度、最适作用pH值、热稳定性、金属离子及抑制剂、酶促动力学等性质。并将菌株应用于发酵章鱼下脚料,经超滤、阴离子交换层析分离获得抗氧化多肽。结果显示:   1.经分离筛选获得产蛋白酶活性最高的菌株Bacillussp.QDV-3,为革兰氏阳性菌,杆状,两端钝圆,有芽孢。菌落为乳白色、圆形、凸起、边缘整齐湿润的光滑型小菌落。生理生化和16SrRNA全序列鉴定其属于细菌,厚壁菌门,杆菌纲,芽孢杆菌目,芽孢杆菌科,芽孢杆菌属,与弯曲芽孢杆菌Bacillusflexus3xWMARB-5有99.2%的同源性。   2.Bacillussp.QDV-3菌株在以果糖为碳源,蛋白胨为氮源,培养基初始pH值8.0,培养温度30℃的条件下振荡培养3.5天时,所产蛋白酶活力最高,培养基中添加Mn2+和Ba2+对菌株产蛋白酶有促进作用,所产蛋白酶在SDS-PAGE电泳上显示至少有5种蛋白酶,分子量分别为32.4、43.3、61.6、96.6和124.2kDa,蛋白酶的最适作用温度为50~60℃,最适作用pH值为9.0~11.0,热稳定性及pH值稳定性均较好;Mn2+、Mg2+对蛋白酶有一定的激活作用;金属蛋白酶抑制剂(EDTA)和丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)对蛋白酶均有显著抑制作用,说明粗酶液中既存在金属蛋白酶也存在丝氨酸蛋白酶。   3.粗酶液经硫酸铵沉淀、CelluloseCM-52阳离子交换层析、DEAE-SephadexA50阴离子交换层析3步分离纯化,纯化倍数为2.5,活性回收率为12.5%,获得电泳级纯蛋白酶QDV-E,该酶分子量为61.6kD,最适反应温度为40℃,属中温酶,最适反应pH值为9.0~9.5,为碱性蛋白酶,且在50℃下热稳定性较好。动力学常数Km为10mg/mL。考察了金属离子及蛋白酶抑制剂对蛋白酶活性的影响,其中Mn2+、Mg2+对其有激活作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂可以完全抑制该酶的活性,说明该酶可能是丝氨酸族蛋白酶。   4.章鱼下脚料多肽经超滤和DEAE-SephadexA50阴离子交换层析分离获得2个活性组分FⅠ和FⅡ,并对不同多肽浓度下FⅠ和FⅡ的清除DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的活性进行了研究。结果显示,FⅠ和FⅡ对3种自由基均有清除作用,且FⅠ的清除作用均强于FⅡ。多肽浓度为0.6mg/mL时FⅠ和FⅡ对羟自由基的清除率最高分别为60.1%和42.3%,IC50分别为0.4mg/mL,0.62mg/mL。
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