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目的:通过微溶胶静电纺丝和胶原自组装技术制备可持续释放VEGF的微/纳米纤维仿生骨膜。验证仿生骨膜通过替代骨膜纤维层,促进早期血运重建和间充质细胞增殖、分化,最终以外源.内源相结合的途径完成骨膜和骨再生的设想。
方法:通过微溶胶(MS)静电纺丝技术合成具有核.鞘结构的纤维,以PLLA(L-聚乳酸)为外鞘,透明质酸(HA)为核芯,其中纤维核芯中包裹了VEGF,并使用胶原(Col)自组装技术最终形成具有微/纳米纤维结构的仿生骨膜。采用扫描电镜、透射电镜、红外光谱和力学测试仪对不同纤维膜(PLLA、MS、PLLA-Col、MS-Col)进行材料表征。通过荧光标记法示踪药物在纤维中的分布情况,以ELISA法探究VEGF的缓释效果。将大鼠间充质干细胞(BMSCs)接种在不同纤维膜上进行培养,以活/死染色、CCK-8法、免疫荧光法、碱性磷酸酶和钙结节染色定量测定,研究仿生骨膜对间充质干细胞的活性、黏附、铺展、增殖及分化的影响。将不同纤维膜和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)通过Trans-well培养板培养,验证释放的VEGF对内皮细胞血管形成能力的影响。最后,使用大鼠颅骨缺损模型评价仿生骨膜材料在体内促骨膜再生和骨缺损修复的能力,以Micro-CT、H&E染色、Masson染色、Periostin和CD31免疫组化染色进行定性和定量分析。
结果:荧光标记示踪显示药物相对均匀一致的分布于每一根纤维当中,VEGF的最终累计释放量约为80.7%±1.4%,并且可持续释放4周以上。细胞活性和增殖实验中,活死染色和CCK-8试验显示了仿生骨膜良好的生物相容性和促进细胞增殖的能力。Integrin和vinculin免疫荧光染色显示了微/纳米纤维结构促进细胞黏附和铺展的能力。成骨分化试验中,ALP活性染色以及钙结节的含量较对照组明显增多。内皮细胞成管试验细胞中,细胞分支节点以及连线长度定量明显高于对照组。在体内动物实验中,仿生骨膜覆盖组有明显的骨膜再生,新生骨(BV/TV)的含量也远高于对照组,且组织切片分析能观察到较多新生血管以及Periostin的线性排列。
结论:微/纳米纤维仿生骨膜具有良好的生物相容性和生物活性,体外能有效促进间充质干细胞的增殖和成骨分化以及内皮细胞的血管形成能力。仿生骨膜在体内具有良好的防止疤痕组织增生,促进血管和骨再生的能力,能够通过外源-内源相结合的途径模拟骨膜的发育过程完成骨膜的修复,并通过骨膜固有的成骨机制来使骨缺损快速而均匀的修复。因此,微/纳米纤维仿生骨膜有希望为临床问题提供有前景的解决策略。
方法:通过微溶胶(MS)静电纺丝技术合成具有核.鞘结构的纤维,以PLLA(L-聚乳酸)为外鞘,透明质酸(HA)为核芯,其中纤维核芯中包裹了VEGF,并使用胶原(Col)自组装技术最终形成具有微/纳米纤维结构的仿生骨膜。采用扫描电镜、透射电镜、红外光谱和力学测试仪对不同纤维膜(PLLA、MS、PLLA-Col、MS-Col)进行材料表征。通过荧光标记法示踪药物在纤维中的分布情况,以ELISA法探究VEGF的缓释效果。将大鼠间充质干细胞(BMSCs)接种在不同纤维膜上进行培养,以活/死染色、CCK-8法、免疫荧光法、碱性磷酸酶和钙结节染色定量测定,研究仿生骨膜对间充质干细胞的活性、黏附、铺展、增殖及分化的影响。将不同纤维膜和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)通过Trans-well培养板培养,验证释放的VEGF对内皮细胞血管形成能力的影响。最后,使用大鼠颅骨缺损模型评价仿生骨膜材料在体内促骨膜再生和骨缺损修复的能力,以Micro-CT、H&E染色、Masson染色、Periostin和CD31免疫组化染色进行定性和定量分析。
结果:荧光标记示踪显示药物相对均匀一致的分布于每一根纤维当中,VEGF的最终累计释放量约为80.7%±1.4%,并且可持续释放4周以上。细胞活性和增殖实验中,活死染色和CCK-8试验显示了仿生骨膜良好的生物相容性和促进细胞增殖的能力。Integrin和vinculin免疫荧光染色显示了微/纳米纤维结构促进细胞黏附和铺展的能力。成骨分化试验中,ALP活性染色以及钙结节的含量较对照组明显增多。内皮细胞成管试验细胞中,细胞分支节点以及连线长度定量明显高于对照组。在体内动物实验中,仿生骨膜覆盖组有明显的骨膜再生,新生骨(BV/TV)的含量也远高于对照组,且组织切片分析能观察到较多新生血管以及Periostin的线性排列。
结论:微/纳米纤维仿生骨膜具有良好的生物相容性和生物活性,体外能有效促进间充质干细胞的增殖和成骨分化以及内皮细胞的血管形成能力。仿生骨膜在体内具有良好的防止疤痕组织增生,促进血管和骨再生的能力,能够通过外源-内源相结合的途径模拟骨膜的发育过程完成骨膜的修复,并通过骨膜固有的成骨机制来使骨缺损快速而均匀的修复。因此,微/纳米纤维仿生骨膜有希望为临床问题提供有前景的解决策略。