1.研究背景：肝癌目前是世界上第五大致死性癌症。在美国和欧洲,肝癌的发病率正在不断升高,目前已成为肝硬化患者死亡的首要原因。尽管手术切除或肝移植术被认为是治疗肝细胞癌的有效方法,但目前仅有约5%-20%的有临床表现的肝癌患者适于肝脏切除。由于从肝硬化演化而来的肝癌患者的肝功能差及供体肝源短缺等原因导致的肝移植术不能有效实施,因此手术切除仍是治疗肝癌的最佳方法。但由于残余肝脏不足等原因,肝切除术仍受到限制,特别是对于复发性肝癌和严重肝硬化的肝癌患者。射频消融术是目前治疗肝脏肿瘤过程中应用最广泛的热消融技术,它的优点包括副作用少、恢复快、肿瘤复发后可以再次使用该方法进行治疗等。然而,肿瘤血管中温度相对较低的血流带走热量导致的“热沉效应”限制了射频消融导致的凝固性坏死的范围,并且,肿瘤消融的不完全已成为肝癌治疗失败的一个主要原因。不少研究着力于克服这些影响射频消融疗效的困难,一些研究已经表明降低肿瘤的血流量可以显著地提高射频消融导致的凝固性坏死的效应。动物实验表明,降低肿瘤的血流量可以提高射频消融导致的凝固性坏死的范围,临床研究也表明,通过阻断门静脉或肝动脉的血流可以显著提高射频消融导致的凝固性坏死的范围。由于阻断门静脉或肝动脉的侵入有创性,所以这些方法不便用于临床。Hines-Peralta等人证实三氧化二砷(俗称“砒霜”,具有抗血管生成的作用)可以减少肿瘤内的血流量,增加射频消融导致的凝固性坏死的范围。当今索拉非尼已经过随机对照试验,成为了的用于治疗进展期肝癌的常规药物。研究表明,索拉非尼可以阻断数种酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸激酶的活性,抑制肿瘤细胞的增殖和促进肿瘤细胞的凋亡。三期临床试验证实了索拉非尼用于治疗晚期肝癌的有效性和安全性,而统计学分析也证实了索拉非尼可显著改善晚期肝癌患者的总体生存率。因此,我们推测射频消融术与索拉非尼的应用相结合可以提高射频消融的疗效。2.研究目的：2.1研究证实索拉菲尼是否能延长肝癌患者的平均生存时间。对于接受射频消融的进展期肝癌患者,索拉菲尼是否能延长射频消融的间隔；2.2体外试验验证索拉菲尼对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)及肝癌细胞系(HepG2)的影响；2.3通过体内试验验证通过口饲索拉菲尼拮抗肿瘤血管生成,能否扩大射频消融引起的肝癌动物模型肿瘤毁损面积。3.实验方法：3.1、病历资料：收集2008年8月至2011年12月之间收治于浙江大学医学院附属第二医院肝胆外科的23例不能手术切除的给予索拉非尼治疗的肝癌患者病历资料,所有患者均规范服用索拉菲尼,其中8人同时联合射频消融治疗。所有参与本实验研究患者均签署知情同意书；本项研究获得本院伦理审查委员会批准。所有患者按照欧洲肝病协会制定的肝癌诊断标准,如不符合则通过肝穿活检证实为肝癌。所有患者接受索拉非尼初始剂量均为400毫克,每日两次,用药时间大于等于12周。相关数据取自患者的临床记录,包括病史、生化检查结果、影像学检查结果,以及其他后续相关信息记录。中位随访时间19.2个月。随访终点为患者死亡,第二终点为连续2次实体瘤疗效评价标准(resist标准)评价为进展。3.2、体外实验：肝癌HepG-2和HUVEC细胞单层培养于10%胎牛血清的RPMI1640培养基。细胞孵箱条件为37℃,含有5%CO2。将不同索拉菲尼处理HUVEC及HepG2后,使用3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenytetrazoliumbromide法(MTT)、流式细胞仪和蛋白免疫印迹方法检测细胞功能变化。3.3体内实验：雄性无胸腺裸鼠饲养于浙江中医药大学实验动物中心SPF级层流柜中,自由获得水和食物。人肝癌细胞皮下植入裸鼠腋下3周后,随机分配对照组或治疗组。每个治疗组每日分别经口灌注40和80毫克每公斤体重的索拉非尼；对照组只给予同等量溶剂。索拉非尼称重后储存于避光干燥的地方,给药前将其加热到60度1分钟,超声20-30分钟以液态形式溶解,给药10天后终止。每日检查小鼠,每周两次测量肿瘤大小。应用200W内部冷却射频消融系统(09036115,伯灵顿,马萨诸塞州)行RFA。小鼠取仰卧位,充分麻醉后直视下,将针尖作用端为1厘米的冷循环射频消融电极插入肿瘤,保持温度70±5℃,持续消融5分钟。RFA后处死小鼠,取出肿瘤,以2-3毫米厚度垂直于射频针轴面切片,挑出最大直径的切片。消融大小经线粒体活性的2%氯化三苯四唑(TTC)的染色后可见,数码相机拍摄图像。测量凝血功能区的面积,分别染色(红色,有活力的组织和白色,烧蚀组织)。所有样品经ImageJ软件处理分析,计算毁损面积。所有施行射频消融的肿瘤切片行HE染色组化检查。每组随机挑选6只荷瘤鼠,切取肿瘤标本置入O.C.T.冰冻切片包埋,肿瘤切片用丙酮4℃下固定10min,山羊血清封闭,DAPI染核。Zeiss共聚焦显微镜观测和采集图像。,将肿瘤组织标本行DAPI和CD31染色,确定肿瘤微血管密度(MVD)。将MVD与肿瘤的生长和消融结果相比较。4.试验结果：4.1临床研究患者平均年龄是52.8岁(38-78岁).男女比例是19：4.所有23名患者都有乙肝后导致的肝硬化。其中19名患者(82.6%)的肝功能处于Child-Pugh A级,4名患者(17.4%)处于Child-Pugh B级.17(73.9%)名患者肝癌分级为巴塞罗那(BCLC)分级b级,其余6名(26.1%)是C级with BCLC stage C.26.1%(6/23)的患者有门静脉癌栓。肿瘤平均直径是5.3cm。所有患者在服用索拉菲尼之前被诊断为进展期肝癌且无法手术,其中13%(3/23)的患者有肝外转移。21名(91.3%)患者在索拉菲尼治疗前至少接受过一种治疗：15(65.2%)名患者曾行肝切除,9(39.1%)名患者曾行插管化疗(transarterial chemoembolization, TACE),14(62.9%)名患者曾行射频。8(34.8%)名患者在服用索拉菲尼后同时行射频治疗,其它15名患者仅行索拉菲尼治疗。本组患者平均随访时间是11.78个月,总中位生存时间是9个月(95%CI,7.547-10.453)。联合射频和索拉菲尼治疗的患者平均生存时间是28.3月(95%CI,18.5-38.2),单用索拉菲尼的平均生存时间是8.4月(95%CI,7.1-9.6)。根据BCLC分期,BCLC B级的患者中位生存时间是11个月(95%CI,5.213-16.787),BCLCC级的患者中位生存时间是9(95%CI,3.342-14.658)月。根据Child-Pugh分级来看,Child A级患者的中位生存时间是11个月(95%CI：6.743-15.257),而Child B的患者是8months (95%CI:4.733-15.257).射频消融患者接受索拉菲尼治疗后可以延长2次射频的间隔时间。4.2体外实验研究通过体外实验研究我们确认索拉非尼可抑制HepG2细胞和HUVEC细胞活力。我们发现索拉非尼对HepG2细胞和HUVEC细胞的具有抗增殖效应,索拉非尼在体外可诱导Hep G2细胞活力相关蛋白下调,并诱导HepG2细胞和HUVEC细胞凋亡、引起细胞周期停滞。4.3体内试验研究小鼠分为3组并用不同剂量的索拉非尼(0,40至80mg/kg)处理10天。这三个小组中,肿瘤生长的差异显著(P<0.01)。射频诱导的肿瘤坏死面积的程度在索拉非尼处理的实验组中显著增加。射频凝固的面积在对照组中测量值为57.29±3.39平方毫米。索拉菲尼预处理的小鼠的肿瘤,射频凝固的面积随剂量显著增加。对比对照组,用索拉非尼(40和80mg/kg)预处理的小鼠的肿瘤在肿瘤血管CD31染色中有所不同。对照组肿瘤显示Ⅲ或Ⅳ度的血管显露而用80mg/kg的索拉菲尼预处理的小鼠肿瘤几乎无血管分布(Ⅰ级)。用40mg/kg的索拉菲尼预处理的小鼠肿瘤为Ⅱ级。用索拉非尼处理后所有的小鼠肿瘤都表现出肿瘤中心的血管分布极大的减少。5.研究结论：5.1射频消融和索拉非尼治疗结合能延长进展的肝细胞癌患者的平均生存时间。5.2索拉非尼抑制Hep2细胞和HUVEC细胞的体外细胞活力。5.3结合射频消融与索拉非尼联合治疗可增强肝癌动物模型的肿瘤毁损区域。