背景:原发性肝癌是全世界常见肿瘤,恶性程度高,预后差。在我国的发病率和死亡率均较高,死亡率位居所有恶性肿瘤第二位。大部分患者就诊时已经为中晚期,手术切除率不足20%。虽然随着手术的进步及放化疗等综合手段的应用,肝癌的治疗效果较前改善,但远期效果依然较差。术后复发与转移也是影响预后的重要因素。因而,探索肝癌发生发展以及转移的分子机制、寻求新的治疗靶点对于提高肝癌的治疗效果、改善预后具有重要意义。WTX位于X染色体上的,其功能主要表现为抑制肿瘤,WTX基因的单次突变就有可能会导致肿瘤的发生。研究表明,WTX基因在Wilms瘤、白血病以及胃癌、结肠癌中均有存在,并对肿瘤的侵袭转移有影响。但是WTX基因与肝癌的关系及作用机制尚不清楚。本实验围绕WTX与肝癌的关系及其可能的机制进行研究。目的:一,检测WTX基因在肝癌患者组织样本及肝癌细胞系中的表达情况,分析WTX表达在肝癌组织及癌旁对照组织的差异表达,探究其表达与肝癌临床病理特征之间的关系,从而明确WTX基因在肝癌组织中的表达状态及其临床研究价值,同时分析WTX基因在肝癌细胞系中的差异性表达。二,通过在低表达的肝癌细胞中转染高表达WTX基因的质粒,以及通过干扰RNA方法低表达肝癌细胞中WTX基因,然后进行细胞学功能实验,探究WTX对肝癌细胞恶性表型的影响。三,通过生物信息学方法筛选WTX基因影响肝癌细胞的生物学行为的下游通路,进一步通过实验验证WTX的具体调控机制,从而寻找WTX作为预测肝癌预后的标志分子,以及为作为肝癌靶向治疗的目标提供依据。方法:一,首先,收集江西省人民医院49例肝脏切除术后保存的肝癌组织及其对应的癌旁组织,所有患者术前均没有其他的恶性肿瘤相关的疾病,而同时患者也未接受过放任何生物治疗、化疗以及放疗等治疗手段。其中,癌旁组织,选择标准为距病灶边缘2cm以上。所有肝癌病灶组织都进行病理切片,并通过病理学的诊断,确诊为肝癌。其次,采用免疫组化方法、Western Blot、荧光定量PCR方法,对收集的肝癌组织以及对照癌旁组织,检测其中WTX蛋白水平和m RNA的表达情况。最后,收集患者的临床病理资料,数据内容包括肝癌的分期、性别、是否感染HBV、肿瘤大小、预后等资料,应用统计学方法分析WTX的表达的临床意义。此外,收集肝细胞株L02以及肝癌细胞株Hep G2、MHCC97L、SMMC-7721、MHCC97H,采用Western Blot以及荧光定量PCR的方法检测WTX基因的表达情况。二,利用脂质体法将高表达WTX基因的质粒和对照空质粒,转入低表达WTX基因的肝癌细胞株Hep G2、SMMC-7721,并通过嘌呤霉素筛选出稳定高表达WTX基因的细胞系和对照细胞系。通过Western Blot以及荧光定量PCR的方法验证稳定细胞系构建成功。通过CCK8、克隆形成实验、划痕实验、transewll、裸鼠皮下成瘤等实验手段,阐述高表达WTX对肝癌细胞增殖以及侵袭转移生物学功能的影响。采用干扰RNA技术在相对高表达WTX基因肝癌细胞MHCC97L中抑制WTX的表达,并采用CCK8、划痕实验、transewll等功能学实验中验证低表达WTX后对肝癌细胞增殖以及侵袭转移生物学功能的影响。三,通过查询TCGA、GEO等公共在线数据库,研究WTX在肝癌中的表达情况及可能相关的下游通路。通过Western Blot方法以及荧光素酶报告基因等方法验证高表达WTX后,肝癌细胞中Wnt的信号通路的变化。高表达WTX同时改变β-catenin,检测TCF家族的转录活性变化。结果:一,1、免疫组化和Western Blot以及荧光定量PCR结果结果显示,WTX基因表达情况在肝癌组织中明显低于对应的癌旁组织,两者之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。2、WTX基因的表达水平与肝癌的临床TNM程度显著相关(P<0.05)。3生存分析结果显示,WTX基因高表达的患者其预后明显优于低表达组。4、Western Blot结果显示正常肝细胞株L02中WTX的表达显著高于肝癌细胞株Hep G2、MHCC97L、SMMC-7721、MHCC97H的表达。而荧光定量PCR的方法也证明了相似的结论。二,1利用脂质体法将WTX基因的质粒和对照空质粒,转入肝癌细系HepG2、SMMC-7721,并通过嘌呤霉素筛选,采用Western Blot结果显示转入WTX质粒的肝癌细胞中,WTX的表达量明显高于对照组。荧光定量PCR的方法结果证明了在m RNA水平上,WTX基因也显著高表达。以上结果提示,WTX稳定表达的细胞系建立成功。2、CCK8实验结果显示,Hep G2、SMMC-7721等肝癌细胞系中,WTX高表达细胞系的增殖能力明显弱于对照组。3、克隆形成实验结果显示,高表达WTX的肝癌细胞系其克隆形成能力明显弱于对照组。4、划痕实验和trasnswell实验证明,高表达WTX能够显著抑制肝癌细胞的侵袭以及迁移的作用。5、皮下移植瘤模型结果显示,高表达WTX的肝癌细胞其成瘤能力显著弱于对照细胞。6、通过转染WTX的干扰RNA,在肝癌细胞系MHCC97L中低表达WTX。7、CCK8实验结果显示,MHCC97L肝癌细胞系中,低表达WTX能够显著增强细胞系的增殖能力。8、划痕实验和trasnswell实验证明,低表达WTX能够显著增强肝癌细胞的侵袭以及迁移的作用。三,1、GEO数据库检索发现,在肝癌组织中,WTX基因的表达明显呈现相对低表达的状态。2、通过cbioportal工具分析TCGA数据库和KEGGpathway数据库,发现WTX表达相关基因能够富集到Wnt信号通路中。WTX相关基因中与Wnt通路重叠基因有25个,提示WTX在肝癌中可能与Wnt通路相关。3、通过Western Blot方法验证高表达WTX后,发现WTX高表达后β-catenin表达明显下降,提示WTX发挥生物学作用的机制可能是通过降低β-catenin的表达,从而抑制Wnt通路,继而发挥抑制肝癌细胞恶性生物学行为的能力。4通过荧光素酶报告实验发现,WTX高表达后TCF的转录活性显著下降,从而也证明Wnt通路被抑制。5高表达WTX同时再上调β-catenin,能够使TCF的转录活性得到逆转。结论:一,WTX基因在肝癌组织中呈低表达状态,并且与TNM分期显著相关,WTX基因高表达的患者其预后明显优于低表达组。二,高表达WTX能够抑制肝癌细胞的恶性生物学行为,高表达WTX能显著抑制肝癌细胞体内外的增殖和转移能力;并且可以抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。低表达WTX能够显著增强肝癌细胞的增殖和侵袭迁移能力。三,WTX基因在肝癌组织中处于低表达状态,并且WTX表达相关基因能够富集在Wnt通路上。WTX基因能够降低β-catenin的表达,降低TCF家族的转录活性,从而抑制Wnt通路,继而发挥抑制肝癌细胞恶性生物学行为的能力。WTX调控TCF家族的转录是依赖于β-catenin的表达。