背景与目的:慢性粒细胞性白血病（CML）的特点是Bcr-Abl酪氨酸激酶的活化。Bcr-Abl基因T315I突变是导致伊马替尼、细胞毒性药物和第二代酪氨酸激酶抑制剂耐药的主要突变类型。慢性粒细胞性白血病患者对伊马替尼耐药的出现，促使人们寻找治疗慢性粒细胞性白血病的新方法。泛素-蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的主要途径，在蛋白质的质量控制和各种细胞进程中调控降解。因此，蛋白酶体抑制剂已经成为潜在的有吸引力的抗癌药物。26S蛋白酶体是由20S核心颗粒（CP），和一端或两端的19S调节颗粒（RP）盖子结构组装而成。去泛素化酶（DUBs）是一种蛋白酶能够从泛素化蛋白上去除泛素，从而改变许多细胞内蛋白的构象和功能，从而调节多种细胞内进程和功能。在哺乳动物中，有三个与19S RP相关的去泛素化酶：Rpn11，USP14和UCH-L5。一些去泛素化酶被发现参与了肿瘤的进展；因此，它们正作为癌症治疗的新靶点。藤黄酸（GA），一种来自中药藤黄的小分子，已被中国食品药品监督管理局（FDA）批准进入癌症治疗的II期临床试验。最近，已经报道了藤黄酸是一种新型的组织特异性蛋白酶体抑制剂，与硼替佐米具有同样效力但更少的毒性。另一药物金诺芬（AF），临床上用于治疗类风湿性关节炎，最近由美国食品和药物管理局（FDA）批准进入癌症治疗的II期临床试验。与金诺芬通过抑制硫氧还蛋白还原酶增加细胞内活性氧（ROS）诱导细胞凋亡的报道不同，最近的研究显示，金诺芬诱发的细胞凋亡依赖于蛋白酶体的去泛素化酶（UCH-L5和USP14）抑制。本课题研究了，在表达Bcr-Abl-T315I突变型和Bcr-Abl野生型的慢性粒细胞性白血病细胞中，藤黄酸和金诺芬对细胞存活或凋亡的影响，并进行了以下试验：　　第1部分藤黄酸在伊马替尼耐药的慢性粒细胞性白血病细胞中的抗肿瘤活性　　1.1藤黄酸抑制Bcr-Abl野生型和突变型慢性粒细胞性白血病细胞增殖及集落形成。KBM5（ Bcr-Abl野生型）细胞是伊马替尼敏感型细胞，而 KBM5-T315I（Bcr-Abl-T315I突变）细胞是伊马替尼耐药型细胞。为了探讨藤黄酸对慢性粒细胞性白血病细胞生长的影响，体外培养的KBM5，KBM5-T315I和K562细胞经不同浓度的藤黄酸处理48小时后， MTS法检测细胞活力。藤黄酸呈剂量依赖性降低KBM5， KBM5-T315I和K562细胞活性，IC50分别为0.32，0.35和0.40μM。为了检验藤黄酸对慢性粒细胞性白血病细胞的长期影响，进行了软琼脂集落形成实验。用0.125至1.25μM浓度藤黄酸处理KBM5，KBM5-T315I和K562细胞12或24小时。经藤黄酸处理24小时的IC50值分别为0.24μM（KBM5细胞），0.34μM（KBM5-T315I细胞）和0.62μM（K562细胞）。　　1.2藤黄酸诱导Bcr-Abl野生型和突变型慢性粒细胞性白血病细胞凋亡。接下来分析了藤黄酸诱导Bcr-Abl野生型和突变型细胞株细胞死亡的能力。藤黄酸处理KBM5, KBM5-T315I和K562细胞，在荧光显微镜下观察PI阳性细胞或用Annexin V/PI流式细胞仪检测。在12小时的时间点, GA呈剂量依赖性引起细胞死亡。　　1.3藤黄酸诱导慢性粒细胞性白血病细胞caspase的激活。Western blot结果显示，在这三个细胞株中藤黄酸呈剂量和时间依赖性诱导PARP的切割。同样的，藤黄酸处理后caspase-3，8和9蛋白的前体形式均下降，caspase-3、-8、-9的活化形式增加，表明藤黄酸通过caspase的激活引发慢性粒细胞性白血病细胞凋亡。藤黄酸处理KBM5和KBM5-T315I细胞后，线粒体膜的完整性降低，在这些细胞中释放出的细胞色素C和AIF水平升高。为进一步发现在这些慢性粒细胞性白血病细胞中，藤黄酸引起抗凋亡蛋白Mcl-1、XIAP、Bcl-2明显下降。　　1.4藤黄酸在慢性粒细胞性白血病细胞中抑制蛋白酶体功能。为了检测藤黄酸对蛋白酶体功能的直接影响，首先研究了体外培养的白血病细胞中的蛋白酶体活性。发现藤黄酸能剂量依赖性地抑制KBM5和KBM5-T315I细胞CT-like活性。此外，在KBM5，KBM5-T315I和K562细胞中，藤黄酸引起泛素化蛋白和蛋白酶体底物蛋白（IκBα、Bax、HSP70、HSP90）的聚集。这些结果证实，在这些白血病细胞中低浓度藤黄酸明显抑制泛素-蛋白酶体功能，与其诱导细胞毒性作用相关。　　1.5藤黄酸抑制Bcr-Abl蛋白和抑制其下游信号。还发现，在KBM5，KBM5-T315I和K562细胞中，藤黄酸降低Bcr-Abl总蛋白和磷酸化水平。进一步的研究结果显示，藤黄酸处理后也能抑制Bcr-Abl下游靶蛋白的水平。CrkL、STAT5、ERK1/2和Akt磷酸化也明显降低，而ERK1/2和CrkL总蛋白水平变化不大；即使Akt和STAT5总蛋白有减少，但晚于其磷酸化蛋白的改变。但藤黄酸不影响Bcr-Abl融合基因mRNA表达，表明藤黄酸介导的Bcr-Abl降低不是发生在转录水平。总之，数据表明，藤黄酸抑制Bcr-Abl蛋白及下游的信号转导通路。　　1.6 caspase-3的激活是Bcr-Abl蛋白及其信号通路下调必需的。为了探讨藤黄酸诱导Bcr-Abl降低的机制，我们研究它是否依赖caspase活化。发现泛caspase抑制剂z-VAD能抑制藤黄酸介导的Bcr-Abl蛋白及其下游蛋白下降，蛋白质合成抑制剂CHX处理后，部分恢复Bcr-Abl下游靶蛋白的水平。与硼替佐米的结果类似。同时，藤黄酸诱导Bcr-Abl减少能被caspase-3抑制剂z-DEVD逆转但不能被组织蛋白酶B抑制剂CA-074Me逆转，表明caspase-3而非溶酶体参与。这些结果表明，藤黄酸和硼替佐米诱导的caspase激活是Bcr-Abl及其下游的信号下调所必需的。　　1.7藤黄酸介导的蛋白酶体抑制是caspase的激活和Bcr-Abl水平降低所必需的。接下来研究的是藤黄酸引起caspase介导的Bcr-Abl水平降低是否由蛋白酶体抑制介导。我们破坏了藤黄酸的碳9和碳10之间的双键（GA~）来与藤黄酸作比较。GA~（0.5μm）不能抑制蛋白酶体活性、诱导 caspase活化、细胞凋亡和Bcr-Abl及其下游蛋白水平降低。由于藤黄酸经细胞内CYP2E1代谢后成为具有活性的蛋白酶体抑制剂，接下来比较了有CYP2E1抑制剂DDC和没有的情况下藤黄酸的效应。DDC大部分恢复藤黄酸引起的PARP切割，caspase活化，Bcr-Abl蛋白水平降低，和蛋白酶体抑制。这些结果表明，藤黄酸介导抑制蛋白酶体后才诱导caspase的激活和Bcr-Abl降低。　　1.8藤黄酸对慢性粒细胞性白血病原发性单核细胞体外作用的研究。下一步评价藤黄酸对骨髓单个核细胞的体外抗肿瘤作用，五例慢性粒细胞性白血病患者（其中两个为伊马替尼耐药），三名健康志愿者的外周血单个核细胞作为对照组。藤黄酸处理的原发性慢性粒细胞性白血病患者细胞活力降低，IC50值在0.58到0.82μM之间，而正常对照 IC50值超过5μM。此外，在所有五例慢性粒细胞性白血病患者单核细胞，0.25至1μM的藤黄酸处理细胞24小时后，PI或Annexin V/PI双染法检测出明显的细胞凋亡。藤黄酸处理后还能显著降低Bcr-Abl、caspase3和9前体、Mcl-1的蛋白水平，引起PARP切割，引起泛素化蛋白和IκB聚集。重要的是，藤黄酸明显抑制慢性粒细胞性白血病骨髓单个核细胞的蛋白酶体活性而在健康志愿者正常单个核细胞只有轻微的抑制。这些结果一致证实，藤黄酸对KBM5和KBM5-T315I细胞的体外抑制作用。　　1.9藤黄酸抑制Bcr-Abl野生型和突变型裸鼠移植瘤的生长。下一步评估了体外和体内裸鼠移植瘤模型中，联合使用藤黄酸和伊马替尼的效应。藤黄酸和伊马替尼单独能够诱导Bcr-Abl磷酸化抑制和PARP切割，而藤黄酸和伊马替尼的联合并不能提高KBM5细胞中这些变化；在KBM5-T315I细胞，藤黄酸而不是伊马替尼，能够诱导Bcr-Abl磷酸化抑制和PARP切割。在体内模型，KBM5和KBM5-T315I细胞接种于裸鼠皮下。然后小鼠经腹腔注射溶剂、藤黄酸（3mg/kg/2天）、伊马替尼（50mg/kg/天）或联合藤黄酸和伊马替尼处理14天。结果发现，藤黄酸处理组可显著抑制Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突变裸鼠移植瘤的生长；藤黄酸组肿瘤重量明显降低，而藤黄酸和伊马替尼并没有明显的协同效应出现，与体外实验结果相一致。藤黄酸处理组Bcr-Abl及其下游目标AKT，ERK1/2和STAT5蛋白水平明显下降，蛋白酶体靶蛋白IκBα和泛素化蛋白高度聚集。表明藤黄酸在伊马替尼敏感型和伊马替尼耐药型裸鼠移植瘤中抑制蛋白酶体功能。检测了一些增殖、分化，粘附和迁移相关的蛋白标志物，如Ki67、CD11b／C、CXCR4、MMP2。发现藤黄酸可以抑制Ki67、CXCR4和MMP2蛋白的水平和上调CD11b/c；而藤黄酸和伊马替尼对这些蛋白的改变没有明显的协同效应。总之，结果表明，藤黄酸能够抑制在体Bcr-Abl野生型及Bcr-Abl-T315I细胞移植瘤。　　第2部分金诺芬在伊马替尼耐药的慢性粒细胞性白血病细胞中的抗肿瘤活性　　2.1金诺芬诱导Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突变型细胞毒性作用:为了探讨金诺芬对慢性粒细胞性白血病细胞生长的影响，金诺芬处理KBM5和KBM5-T315I细胞后，体外培养48小时，用MTS法检测细胞活力。我们发现金诺芬可剂量依赖性地降低KBM5和KBM5-T315I细胞的存活率，IC50值分别0.57和0.50μM。　　接下来分析了在BCR-ABL-T315I突变和野生型细胞中，金诺芬动态引起细胞死亡情况。金诺芬处理KBM5和KBM5-T315I细胞后，通过使用台盼蓝拒染实验，记录台盼蓝染色阳性细胞数，观察到细胞死亡比例明显增加。同样，浓度梯度的金诺芬处理KBM5和KBM5-T315I细胞后，用流式细胞术检测，金诺芬引起细胞AnnexinV/PI阳性结果显著增加，表明金诺芬能够诱导慢性粒细胞性白血病细胞凋亡。　　2.2金诺芬在慢性粒细胞性白血病细胞中诱导caspase的激活:金诺芬处理KBM5和KBM5-T315I细胞，检测凋亡相关变化。Western blot分析显示，在这两个慢性粒细胞性白血病细胞系中，金诺芬呈剂量和时间依赖的方式引起PARP切割。同时，金诺芬处理后caspase-3，8和9的前体形式均降低，而活性形式增加，这表明金诺芬触发caspase依赖的慢性粒细胞性白血病细胞凋亡。在金诺芬处理KBM5和KBM5-T315I细胞后，线粒体膜的完整性降低，释放到细胞质中的细胞色素C和AIF均升高。为进一步探讨金诺芬诱导细胞凋亡的机制，研究了金诺芬对其他凋亡相关蛋白表达的影响。在KBM5和KBM5-T315I细胞中，金诺芬引起抗凋亡蛋白包括Bcl-2、survivin、XIAP的水平显著下降，而Bcl-xL、Mcl-1、Bax的水平没有显著变化。　　2.3金诺芬降低Bcr-Abl蛋白并抑制其下游信号:还发现，在KBM5和KBM5-T315I细胞中，金诺芬呈剂量依赖性和时间依赖性降低Bcr-Abl总蛋白和磷酸化水平。此外，金诺芬降低Bcr-Abl下游靶蛋白的水平。STAT5、ERK1/2和Akt的磷酸化均明显减少，而ERK1/2总蛋白水平变化不大，即便Akt和STAT5总蛋白呈下降趋势。Akt和STAT5总蛋白的减小晚于其磷酸化形式的变化。总之，我们的数据表明，金诺芬能够诱导Bcr-Abl蛋白水平下降，并抑制Bcr-Abl下游信号。　　2.4 Bcr-Abl减少与金诺芬下调基因表达和caspase依赖的切割相关:为了探讨在金诺芬介导的Bcr-Abl蛋白水平降低的机制，我们检测了Bcr-Abl转录水平表达。金诺芬处理KBM5和KBM5-T315I细胞6小时后，采用RT-qPCR检测Bcr-Abl mRNA表达。我们发现金诺芬可以在一定程度上降低Bcr-Abl mRNA水平。但Bcr-Abl mRNA表达减少的程度比Bcr-Abl蛋白水平降低的程度要小，这表明金诺芬诱导Bcr-Abl转录水平的抑制可能不能完全，但只能部分解释Bcr-Abl蛋白水平的降低。通过比较去泛素化酶抑制剂金诺芬和蛋白酶体抑制剂硼替佐米对Bcr-Abl蛋白水平的影响，金诺芬和硼替佐米均能引起泛素化蛋白聚集，激活caspase和降低Bcr-Abl，但金诺芬似乎在降低Bcr-Abl和p-Bcr-Abl蛋白水平方面比硼替佐米更有效，与金诺芬能下调Bcr-Abl基因的结论是一致的。　　2.5 caspase的激活介导了金诺芬引起的Bcr-Abl水平降低:我们和其他人报道了，Bcr-Abl融合基因可被caspase活化后切割。观察到泛caspase抑制剂Z-VAD-fmk可在一定程度上抑制金诺芬介导的细胞死亡，Bcr-Abl及其下游信号蛋白降低，但并没有减弱泛素化蛋白的积累。这些结果表明，金诺芬诱导caspase的激活是Bcr-Abl融合基因及其下游信号降低所必需的。　　2.6蛋白酶体抑制但不是ROS介导了金诺芬引起的Bcr-Abl水平降低，caspase的激活和细胞凋亡:发现在KBM5和KBM5-T315I细胞中，金诺芬呈剂量和时间依赖性引起泛素化蛋白和蛋白酶体特异性底物蛋白聚集；金诺芬不改变KBM5和KBM5-T315I细胞20S蛋白酶活性。一般认为，金诺芬通过诱导活性氧（ROS）的产生引起凋亡。下一步我们验证蛋白酶体抑制和ROS在慢性粒细胞性白血病细胞中的细胞毒性作用。发现金诺芬确实能够诱导慢性粒细胞性白血病细胞ROS的产生。含巯基的抗氧化剂（NAC， GEE）和非巯基-抗氧化剂（TBHQ、维生素C）都能抑制金诺芬诱导的ROS的产生；然而，只有含巯基的抗氧化剂，而不是非巯基的抗氧化剂，可以完全阻止金诺芬诱导的蛋白酶体抑制、Bcr-Abl水平降低和细胞凋亡。这些证据表明，金诺芬诱导的蛋白酶体抑制，而不是ROS的产生，介导了caspase活化和Bcr-Abl降低。　　2.7金诺芬抑制BCR-ABL野生型和T315I突变型裸鼠移植瘤的生长:下一步评估金诺芬在裸鼠移植瘤模型中的在体抗肿瘤效应。KBM5和KBM5-T315I细胞接种于裸鼠皮下。小鼠经腹腔注射溶剂或金诺芬（7毫克/公斤/天）12天。结果发现，金诺芬组可显著抑制Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突变型裸鼠移植瘤的生长；肿瘤重量明显降低。金诺芬组肿瘤中Bcr-Abl和其下游的目标包括Akt，ERK1/2和STAT5磷酸化蛋白水平以及Bcr-Abl，STAT5和Akt总蛋白明显减少，而金诺芬组泛素化蛋白和IκBα大量聚集。Ki67蛋白的免疫组化结果提示，金诺芬抑制KBM5-T315I和KBM5移植瘤的增殖。总之，结果表明，金诺芬不仅能抑制Bcr-Abl野生型也能抑制伊马替尼耐药的Bcr-Abl-T315I突变型慢性粒细胞性白血病细胞移植瘤肿瘤的生长。　　结论：　　（1）藤黄酸能够诱导慢性粒细胞性白血病细胞凋亡和抑制细胞增殖，并能抑制伊马替尼耐药Bcr-Abl-T315I裸鼠移植瘤的生长。结果表明，藤黄酸诱导的蛋白酶体抑制是诱导伊马替尼耐药和敏感型慢性粒细胞性白血病细胞的caspase活化所必需的，而caspase活化是藤黄酸诱导Bcr-Abl降低和细胞凋亡所必需的。　　（2）金诺芬能够诱导Bcr-Abl野生型细胞和Bcr-Abl-T315I突变细胞凋亡并抑制伊马替尼耐药的Bcr-Abl-T315I在体移植瘤生长；金诺芬通过下调Bcr-Abl融合基因和蛋白酶体抑制引起caspase活化介导的Bcr-Abl切割来抑制Bcr-Abl；蛋白酶体抑制，而不是ROS，是金诺芬诱导的caspase激活和细胞凋亡所必需的。这些研究结果表明，藤黄酸和金诺芬可能在伊马替尼耐药的癌症治疗方面具有很重要的临床意义。