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目的：探讨转染外源野生型p53(wtp53)基因对肝癌耐药细胞株Bel-7402的生长的抑制作用，并了解p53基因与Bel-7402细胞对长春新碱敏感性之间的关系。
方法：构建人类p53基因表达序列与真核表达载体PCR3.1的重组体，转化感受态大肠杆菌，Amp抗性筛选阳性重组子，BamH1、EcoR1酶切鉴定，利用特异性引物进行PCR扩增及测序分析鉴定；利用脂质体介导，将含人野生型p53cDNA表达序列的pCR3.1-p53重组体质粒导入人肝癌耐药细胞株Bel-7402中，用G418筛选阳性克隆，将其扩增传代，建立转染细胞株。应用MTT法，研究P53基因对长春新碱在细胞株Bel-7402中药物敏感性。采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析耐药基因MDR1、谷胱甘肽S转移酶Pi(GSTπ)、拓扑异构酶Ⅱα(TopoⅡα)和多药耐药相关蛋白(MRP)表达的变化。通过流式细胞技术(FCM)观察转染野生型p53基因后细胞凋亡和细胞周期的影响。通过免疫细胞化学观察P-糖蛋白的表达情况。
结果：所构建的PCR3.1-p53经BamH1、EcoR1酶切所得片段均与预期相符，利用特异性引物可扩增出p53基因表达序列片段相应PCR产物，经序列测定和分析，重组体中p53cDNA序列与Genebank登录序列一致；脂质体转染，在G418选择培养基中培养两周后，成功地筛选出阳性细胞克隆。生长曲线显示p53基因转染对Bel-7402细胞的生长有明显的抑制作用；MTT法证明p53基因表达阳性的Bel-7402细胞对长春新碱的敏感性明显增强；免疫细胞化学结果显示，PCR3.1-P53转染的Bel-7402细胞膜P-gp呈阴性表达，而阳性对照的PCR3.1转染Bel-7402细胞及阴性对照的Bel-7402细胞膜P-gp均呈阳性表达；FCM结果表明，p53基因转染可明显加强Bel-7402细胞在G1期的阻滞作用并可增加Bel-7402细胞的凋亡率，协同VCR对Bel-7402细胞凋亡率从10.38％到51.93％，凋亡可能是野生型P53基因提高Bel-7402对化疗药物敏感的原因之一；RT-PCR结果表明，p53对Bel-7402细胞的MDR1/Pgp的表达有明显的抑制作用。我们对TopoⅡα、GSTπ、MRP基因表达进行了同步测定，发现p53基因对TopoⅡα基因的表达有上调作用，对GSTπ、MRP基因表达没有影响。转染p53的Bel-7402细胞对VCR敏感性的增加，可能通过降低MDR1/mRNA和Pgp的表达、上调TopoⅡα表达从而增加了细胞内VCR药物浓度和发挥VCR药效。
结论：野生型p53基因转染能使天然耐药细胞株Bel-7402细胞出现生长抑制和对VCR敏感性增强，其可能机制为凋亡诱导、降低MDR1/mRNA和Pgp的表达、上调TopoⅡα的表达，增加细胞内药物积累，加强VCR对Bel-7402在G1期的阻滞作用等。wtp53基因联合化疗药物治疗可望开辟克服肝癌耐药的新途径，并且为深入理解肿瘤多药耐药性及开发新型逆转剂提供理论基础和信息。在本研究工作开始之前尚未见国内外的相关报道。