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[目的]心肌梗死可导致心脏组织损伤和一系列病理变化。微小RNA (miRNAs)是一类长约22nt的非编码单链RNA,与靶基因mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)结合后,通过降解mRNA或抑制翻译调节靶基因的表达。硫化氢(H2S)是调节心血管功能的新型气体信号分子,在心脏中主要由胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)催化生成。新近研究发现miRNA和H2S均参与心肌缺血性损伤的保护,但miRNA与H2S生成之间的关系目前并不清楚,尤其是miRNA对CSE的调节也知之甚少。本研究旨在找出调控内源性H2S生成的miRNA,及其通过调控H2S生成在保护心肌缺血性损伤中的作用。[方法]1.通过1niRNA靶基因预测软件(TargetScan, miRanda, miTarget等)分析在心脏当中对CSE酶具有潜在调控作用的miRNA。然后通过结扎冠状动脉左前降支建立大鼠和小鼠的心肌缺血模型,结合软件预测结果,分别在梗死区,梗死边缘区,非梗死区,应用TaqMan real time-PCR技术确认预测的miRNA在心肌缺血模型中是否表达异常。同时检测梗死区,梗死边缘区,非梗死区组织中H2S的浓度,并应用real time-PCR和western blot检测这三个区域中CSE mRNA和蛋白表达的变化,确认CSE的表达变化,H2S的浓度变化和miRNA的表达变化是否对应；2.应用分子克隆技术将CSE mRNA的3’-UTR克隆到pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告载体中,应用双荧光素酶报告基因检测系统(Dual-luciferase assay)确认miRNA对CSE 3’-UTR的直接调控；3.急性分离乳鼠原代心室肌细胞,用脂质体lipofectamin RNAiMAX转染选定的miRNA模拟物(miRNA mimics)及其特异的抑制剂(miRNA inhibitors):1)应用western blot技术、real time-PCR技术等检测这些miRNAs对CSE蛋白和mRNA表达的影响,确定选定miRNA对CSE表达的调控；2)检测转染48小时后细胞上清液中H2S的浓度变化,确认对H2S生成的影响；3)转染48小时后,用缺氧培养箱(5%CO2,1%O2和94%N2)对细胞进行缺氧8小时处理,用MTT和Tunel检测细胞活力和凋亡,同时检测细胞上清中LDH的含量,确认miRNA mimics和inhibitor对原代细胞缺血缺氧损伤的影响,结合细胞上清液中H2S的浓度变化结果来验证miRNA调节H2S生成之后对缺血缺氧引起的细胞损伤的影响。4.将经锁核酸修饰的miRNA抑制剂(LNA-miRNA inhibitor)通过尾静脉注入C57小鼠体内,连续注射3天之后,用TaqMan real time-PCR确认mRNA成功下调,之后建立心肌梗死模型。1)应用TTC和Evans blue双染色检测梗死区面积大小,评价LNA-miRNA inhibitor对心肌梗死的影响；2)应用心脏超声评价LNA-miRNA inhibitor对心梗后心功能的改善作用(射血分数EF,缩短分数FS,左室收缩末期容积LVESV,左室舒张末期容积LVEDV); 3)应用western blot技术检测CSE表达的变化,同时检测血浆中H2S产生的变化,确定LNA-miRNA inhibitor对CSE表达和H2S生成的调控；4)检测血浆中心梗标志物LDH, CK和cTn-I含量的变化,确认LNA-miRNAinhibitor对心肌梗死的影响；5) Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达,进一步确认LNA-miRNA inhibitor对心肌凋亡的影响。[结果]1.大鼠心梗48小时后血浆中H2S含量明显降低,梗死心脏不同区域的组织中(包括梗死区,非梗死区,梗死边缘区)H2S含量也明显减少；梗死边缘区和非梗死区心脏组织中CSE mRNA和蛋白表达明显下调,而在梗死区CSE表达代偿性增加；2.miRNA靶基因预测软件分析发现miR-30家族(包括miR-30a, miR-30b, miR-30c, miR-30d, miR-30e)对CSE具有潜在的调控作用；在大鼠和小鼠心梗模型梗死边缘区和非梗死区,TaqMan real time PCR结果显示miR-30家族各个成员表达明显升高,而梗死区,miR-30家族表达则明显下调。3.在原代乳鼠心肌细胞中,过表达miRNA-30家族各个成员,均可以明显抑制CSE mRNA的表达,降低CSE蛋白的表达；而应用不同浓度的LNA修饰的miR-30家族抑制剂(LNA-miR-30 family inhibitor),可以下调原代乳鼠心肌细胞中miR-30家族的表达,同时可以剂量依赖性地增加CSE mRNA和蛋白的表达；4.免疫荧光结果显示转染miRNA-30家族各个成员的模拟物(miR-30 mimics)后,荧光强度均明显减弱,说明CSE蛋白的表达下调,而转染LNA-miR-30 family inhibitor后,荧光强度增强,说明CSE蛋白的表达增加；5.双荧光素酶报告基因检测结果显示miRNA-30家族各个成员模拟物可以直接作用于CSE的3’-UTR端,明显抑制荧光素酶的活性。6.miR-30家族各个成员的模拟物均明显地减少细胞上清中H2S的生成,而LNA-miR-30 family inhibitor可以明显地增加细胞上清中H2S的含量。7.在缺血缺氧处理8h之后,miR-30家族各个成员的模拟物均明显地减少原代心肌细胞的活力,增加LDH漏出率,增加缺血缺氧引起的细胞凋亡率；而LNA-miR-30 family inhibitor则可以改善原代心肌细胞的活力,减少LDH漏出率,减少缺血缺氧引起的细胞凋亡。8.连续三天尾静脉注射LNA-miR-30 family inhibitor (5mg/kg)可以有效抑制体内miR-30家族各个成员的表达；并且剂量依赖性地增加小鼠心脏中CSE mRNA和蛋白的表达,且在2.5mg/kg达到最佳效果。9.与注射Saline组和注射Scrambled NC组相比,注射LNA-miR-30 family inhibitor可以明显的减小梗死面积；减少血浆中CK、LDH和cTn-I含量；改善心肌梗死后小鼠的心脏功能,明显降低左心室收缩期和舒张期内径,降低左心室收缩末期和舒张末期容积,同时明显增加射血分数和缩短分数。10.LNA-miR-30 family inhibitor可以增加心梗后左心室CSE蛋白的表达,同时增加心梗小鼠血浆中H2S的含量。11. LNA-miR-30 family inhibitor可以增加左心室Bcl-2的表达,降低Bax的表达,从而减少左心室心肌细胞的凋亡。[结论]1.miR-30家族对CSE具有直接的调控作用,CSE是miR-30家族的一个靶基因；2.miR-30家族在原代心肌细胞缺血缺氧性损伤中起到调控作用,过表达miRNA-30家族加重心肌细胞缺血缺氧损伤,而抑制miRNA-30家族可以保护心肌细胞缺血缺氧损伤,其机制与miR-30家族调节CSE表达,调控H2S生成相关；3.抑制心脏中miR-30家族表达,可以增加CSE表达,增加H2S生成,从而保护小鼠心肌缺血性损伤。