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目的:研究高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞(mesangial cell,MC)内氧化应激状态与一氧化氮(NO)生成的关系及其可能的分子机制。
方法:大鼠肾小球系膜细胞高糖培养,设立正常对照组(NS组)、甘露醇对照组(MA组)、高糖组(HG组)、高糖溶剂对照组(DMSO组)、NO供体组(SNP组)、过氧化氢组(H2O2组)、TGF-β1抑制剂组(SB431542组)、过氧化氢与TGF-β1抑制剂共培养组(HS组)、NADPH氧化酶抑制剂(DPI组)。按需要,分别于16 h检测以下各项指标:用Griess试剂显色法测定MC中NO的释放量;RT-PCR法测定细胞转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)mRNA、前凋亡基因Bim(Bcl-2 interacting mediator of cell death,Bim)mRNA的相对含量;westernblot法测定细胞中Bim、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)蛋白表达水平;四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法测定细胞增殖活力。
结果:所有结果均显示NS组与MA组比较,差异无统计学意义(P＞0.05);HG组与DMSO组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。
1,NO释放量的变化
HG组检测4 h、10 h、16 h、28 h4个时间点时NO的释放量,其他各组均只检测16 h时的结果。HG组(4个时间点)、H2O2组与NS组比较NO释放量均增加,差异有统计学意义(P＜0.01);DPI组、SB431542组与DMSO组比较,NO释放量均减少,差异有统计学意义(P＜0.01);HS组与H2O2组比较,其NO释放量减少,差异有统计学意义(P＜0.01)。
2.TGF-β1 mRNA水平的变化
PCR结果显示,与NS组比较,HG组、H2O2组以及SNP组TGF-β1 mRNA水平均较NS组有所提高,差异有统计学意义(P＜0.05);SB431542组、DPI组与DMSO组比较,TGF-β1 mRNA水平均下降,差异有统计学意义(P＜0.05);HS组与H2O2组比较,其TGF-β1 mRNA水平降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。
3.Bim的差异
HG组、H2O2组以及SNP组与NS组比较,Bim mRNA水平及其蛋白表达均减少,差异有统计学意义(P＜0.01,或P＜0.05);SB431542组、DPI组与DMSO组比较,Bim mRNA水平及蛋白表达均提高,差异有统计学意义(P＜0.01,或P＜0.05):HS组与H2O2组比较,HS组Bim mRNA增多、蛋白表达增加,差异有统计学意义(P＜0.05)。
4.iNOS表达的差异
HG组、H2O2组与NS组比较,iNOS表达均增加,差异有统计学意义(P＜0.01,或P＜0.05);SB431542组及DPI组与DMSO组比较,iNOS表达均降低,差异有统计学意义(P＜0.01,或P＜0.05);HS组与H2O2组比较,其iNOS表达降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。
5.MTT结果
MTT结果显示,与NS组比较,HG组、SNP组及H2O2组OD值均较高,差异有统计学意义(P＜0.01,或P＜0.05);SB431542组和DPI组与DMSO组比较,其OD值均较低,差异有统计学意义(P＜0.01);HS组与H2O2组比较,HS组OD值较低,差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论:
1.高糖培养的大鼠MC中NO的大量释放与高糖诱导的氧化应激上调TGF-β1的作用有关。
2.大量释放的NO又可进一步促使大鼠MC中TGF-β1的上调,进而进一步增加细胞内NO的生成。