第一部分胆汗酸在十二指肠空肠旁路术改善大鼠2型糖尿病中的作用背景糖尿病是一组以慢性血糖水平升高为特征的代谢性疾病,其中2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)占90%以上。全球目前有4.15亿成人糖尿病患者,相关的防治费用超过6730亿美元；预计到2040年,成人糖尿病患者总数将达到6.42亿。庞大的糖尿病患者群体和巨额开支使糖尿病的防治成为亟待解决的公共卫生问题。传统治疗T2DM的方法虽然可以在短时间内改善血糖,但其长期效果不理想。减重／代谢手术(Bariatric/metabolic surgery)最初是针对严重肥胖的人群设计的、以减轻体重为目的的一组手术方式。大量证据表明,减重／代谢手术有治疗T2DM的作用,且效果优于传统内科治疗。目前,减重／代谢手术已被中华医学会糖尿病学分会、美国糖尿病协会(ADA)和国际糖尿病联盟(IDF)列为T2DM的治疗措施之一。十二指肠空肠旁路术(Duodenal-jejunal bypass, DJB)是一种代谢手术,可以在不引起体重下降的前提下迅速、持久地改善T2DM,但具体机制不明。DJB术以Roux-en-Y的方式重建了肠道结构,改变了胆汁的流向,并且伴有术后血清胆汁酸水平的显著升高。最新证据表明,胆汁酸可以作为信号分子在调节机体糖脂代谢方面发挥重要作用。DJB术改善T2DM的作用是否与胆汁酸相关尚不明确。目的本研究以高脂饮食(High-fat-diet,HFD)联合链脲霉素(Streptozotocin, STZ)诱导的T2DM大鼠为模型,分别实施胆汁转流术(Bile diversion,BD)、DJB术和假手术(SHAM),通过对比三种手术的效果,研究以下问题：(1)BD术能否模拟DJB手术对血清总胆汁酸的影响；(2)BD术是否具有类似DJB的手术效果；(3)胆汁酸是否在DJB改善T2DM的过程中起关键作用。方法本研究中,我们使用HFD/STZ诱导的方法建立了T2DM大鼠模型,并将所有大鼠分为3组,每组10只,分别接受BD术,DJB术和SHAM术。BD术中,我们使用自制的胆汁转流管,在不改变肠道结构的前提下,直接将大鼠胆总管内的胆汁转流到与DJB术中空肠-空肠吻合位置相同的远端空肠,模拟DJB手术对胆汁流向的影响。术后常规记录大鼠进食量和体重,并在术后2周和8周对各组大鼠的糖脂代谢、胆汁酸、肝功、胰岛素和胰高血糖素样肽-1 (Glucagon-like peptide-1,GLP-1)进行检测,对比三种术式的手术效果。结果1.术前和术后各个时间点,DJB组与SHAM组大鼠体重无差别(P>0.05)。术后8周,BD组大鼠体重低于SHAM组(P<0.05),但与DJB组相比无统计学差异。各组大鼠在进食量方面无差别(P>0.05)。2.术前各组大鼠的空腹血糖和胃内葡萄糖耐量试验(IGGTT)结果无差别(P>0.05)。术后2周和8周,DJB组和BD组大鼠空腹血糖和AUCIGGTT均显著下降,明显低于SHAM组(P<0.05)。术后8周,BD组空腹血糖和AUCIGGTT水平高于DJB组(P<0.01)。3.术后2周,空腹和餐后血清总胆固醇水平在三组间无显著差异(P>0.05)。BD组空腹和餐后甘油三酯与游离脂肪酸水平显著低于SHAM组和DJB组(P<0.05),SHAM组和DJB组间无显著差异(P>0.05)。术后8周,各组血清总胆固醇和游离脂肪酸水平无进一步变化。DJB组空腹和餐后甘油三酯水平下降,显著低于SHAM组(P<0.05)。4.术后SHAM组与BD组HOMA-IR无显著差别(P>0.05),而DJB组HOMA-IR在术后2周和8周均显著低于SHAM组和BD组(P<0.05)。5.术后2周,各组大鼠GLP-1分泌无显著差别(P>0.05)。术后8周,BD组和DJB组GLP-1分泌增强,显著高于SHAM组(P<0.05)。6.术后2周,BD组大鼠血清总胆汁酸水平显著高于SHAM组(P<0.05);DJB组总胆汁酸水平亦高于SHAM组,但尚未达到显著统计学差异(P=0.10)；BD组与DJB组间无明显差别(P>0.05)。术后8周,SHAM组总胆汁酸水平无变化,DJB组和BD组进一步升高,显著高于SHAM组(P<0.05),两组间比较无差别(P>0.05)。7.术后2周,血清ALB、ALT、AST和TBIL在各组间无显著差异(P>0.05)。血清ALP水平在DJB组和BD组较低(P<0.05),但两组间无显著统计学差异(P>0.05)。术后8周,DJB组血清ALT、AST和ALP均低于SHAM组(P<0.05)。BD组血清AST和ALP亦低于SHAM组(P<0.05),但其ALP高于DJB组(P<0.05)。结论1.BD手术可以在T2DM大鼠模型上模拟DJB手术对胆汁酸的影响,引起血清总胆汁酸水平的显著升高。2.BD手术可以改善T2DM大鼠的糖代谢,但其效果逊于DJB手术。3.胆汁酸在DJB手术改善T2DM中发挥重要作用,但其他相关因素(如近端小肠脂质感受机制、肠促激素等)可能也是DJB手术改善T2DM的重要机制。第二部分十二指肠空肠旁路术对大鼠血清胆汁酸谱及肠道菌群的影响背景减重/代谢手术可以迅速、持久地缓解T2DM,但具体机制不明。近年来研究发现,减重/代谢手术后血清总胆汁酸水平普遍升高,提示胆汁酸可能在减重/代谢手术中发挥重要作用。胆汁酸由肝脏合成分泌,促进脂质和脂溶性维生素的消化吸收,曾被戏称为“肠道肥皂”。近期研究发现,胆汁酸可以作为信号分子,激活体内的G蛋白偶联受体(TGR5),增加机体的能量消耗,促进GLP-1的分泌。胆汁酸还是法尼醇X受体(Farnesoid X receptor,FXR)的天然配体。肝内FXR的激活可以减少肝脏糖异生和脂肪的合成,调节糖脂代谢。胆汁酸是一类物质的总称,包含超过20种不同类型的胆汁酸(胆汁酸谱),且不同类型的胆汁酸对代谢的影响不尽相同。鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA)是FXR的强效激活剂,胆酸(Cholic acid,CA)对FXR仅有微弱的激活作用,而熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid, UDCA)和p鼠胆酸(p-muricholic acid,β-MCA)却是FXR的抑制剂。与游离型胆汁酸和甘氨酸结合型胆汁酸相比,牛磺酸结合型胆汁酸对TGR5的激活作用更强。此外,胆汁酸还与肠道菌群密切相关。次级胆汁酸的生成需要肠道细菌7α脱羟基酶的作用,而胆汁酸浓度的变化可以影响肠道菌群的结构。传统的胆汁酸检测方法(如3α酶循环法)只能对总胆汁酸进行检测,无法进一步确定各组分的含量。减重／代谢手术后,血清总胆汁酸水平升高,同时也可能伴有胆汁酸谱各组分的变化。因此,明确DJB术后胆汁酸谱及肠道菌群的改变有助于进一步揭示减重／代谢手术改善T2DM的机制。目的本研究以HFD/STZ诱导的T2DM大鼠为模型,实施DJB手术,并与假手术组对比,研究以下问题：(1)DJB术后血清胆汁酸谱的变化；(2)DJB术后肠道菌群的改变。方法本研究中,我们将STZ/HFD诱导的T2DM大鼠分为2组,每组10只,分别接受DJB术和假手术(SHAM)。于术后2周和12周评估手术效果,并使用高效液相色谱串联质谱技术(HPLC-MS/MS)对血清胆汁酸谱进行分析；使用Illumina MiSeq高通量测序平台对粪便中的菌群进行分析,明确DJB手术对血清胆汁酸谱和肠道菌群的影响。结果1.术前,DJB组和SHAM组大鼠的体重、进食量和IGGTT结果均无显著差别(P>0.05)。术后11周和12周,SHAM组大鼠进食量显著高于DJB组(P<0.05)。术后2周和12周,DJB组大鼠血糖出现明显改善,并伴有胰岛素敏感性的升高和GLP-1分泌的增强。两组大鼠在术后胰岛素分泌、体重方面无差别(P>0.05)。2.DJB组大鼠在回肠末段和结肠肠腔内的总胆汁酸浓度均高于SHAM组(P<0.05)。术后DJB组和SHAM组大鼠粪便总胆汁酸浓度无差别。术后2周和12周,DJB组血清总胆汁酸浓度均显著高于SHAM组(P<0.01)。3.手术后,胆酸(Cholic acid,CA)占SHAM组大鼠血清胆汁酸总量的50%以上,而在DJB组的比例不足40%。术后2周,SHAM组和DJB组大鼠血清胆汁酸谱的组成无显著统计学差异(P>0.05)。术后12周,除牛磺脱氧胆酸(Taurodeoxycholic acid,TDCA)和牛磺鹅去氧胆酸(Taurochenodeoxycholic acid, TCDCA)外,DJB组所有牛磺酸结合型胆汁酸的比例均显著高于SHAM组(P<0.05)。4.大鼠粪便菌群主要由拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门构成,占总量的90%以上。术后,SHAM组大鼠以拟杆菌门为主,而DJB组以厚壁菌门和变形菌门为主。当错误发现率设定在5%时,与SHAM组相比,DJB组拟杆菌门的数目在术后2周和12周均显著低于SHAM组(P<0.05)；术后2周,DJB组厚壁菌门的数目显著高于SHAM组(P=0.019)。其他菌门在两组间无显著差异(P>0.05)。当错误发现率设定在25%时,DJB组厚壁菌门的数目在术后2周和12周均显著高于SHAM组(P=0.019,P=0.186)。术后2周,DJB组变形菌门的数目也显著高于SHAM组(P=0.186)。5.术后12周,结肠内总胆汁酸水平与粪便中拟杆菌门的数目呈负相关(r=-0.73,P<0.001),与粪便中变形菌门的数目呈正相关(r=0.62,P<0.001)。结论1.DJB术后,T2DM大鼠的血清总胆汁酸水平显著升高,且以牛磺酸结合型胆汁酸的升高为主。2.DJB术后T2DM大鼠的肠道菌群出现改变,厚壁菌门和变形菌门数目上升,拟杆菌门数目下降。3.DJB术后T2DM大鼠肠道菌群和胆汁酸的改变可能是两者相互作用、相互影响的结果。第三部分十二指肠空肠旁路术影响大鼠胆汁酸代谢的机制背景胆汁酸是胆汁的主要成分,由肝细胞以胆固醇为原料合成。直接由肝细胞合成的胆汁酸称为初级胆汁酸,包括胆酸(Cholic acid,CA)和鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid,CDCA)。在远端肠道内,初级胆汁酸在细菌的作用下被水解,7α位脱羟基后形成次级胆汁酸,主要包括脱氧胆酸(Deoxycholic acid, DCA)和石胆酸(Lithocholic acid,LCA)。胆汁酸根据其是否与氨基酸结合,又分为结合型胆汁酸和非结合型胆汁酸。正常情况下,人体内的大部分胆汁酸均以结合型胆汁酸的形式存在,非结合型较少。在末段回肠,超过95%的胆汁酸被重吸收,通过门静脉系统被肝细胞重新摄取利用,形成胆汁酸的肠肝循环。门静脉中不能被肝细胞重吸收的胆汁酸则溢出进入下腔静脉,形成外周循环中的胆汁酸。我们在前两部分研究发现,胆汁酸是DJB手术改善糖脂代谢的重要机制。DJB术后,血清牛磺酸结合型胆汁酸及总胆汁酸水平均显著上升。引起这一变化的具体原因尚不清楚,我们推测与手术改变了胆汁酸的代谢有关。DJB术以Roux-en-Y的方式重建了肠道结构,改变了胆汁的正常流向,使胆汁不再流经十二指肠和近端空肠,而是直接进入远端空肠。小肠解剖结构的改变缩短了胆汁酸肠肝循环的距离,可能导致高浓度的胆汁酸在远端肠道积聚,促进胆汁酸的重吸收,并最终引起血清胆汁酸水平的升高。然而,血清胆汁酸是肝脏胆汁酸合成、肠道胆汁酸重吸收及肝脏胆汁酸重摄取三个过程的综合反映；血清胆汁酸水平的升高也可能是肝内胆汁酸合成增多或是多种因素共同作用的结果。目前,尚没有关于DJB术后胆汁酸代谢变化的相关报道。目的本研究的主要目的是探索DJB对胆汁酸代谢的影响,进而明确DJB术后血清总胆汁酸水平升高、牛磺酸结合型胆汁酸增多的分子生物学机制。方法本研究利用第二部分研究留存的肝脏和肠粘膜标本,通过Western Blot技术检测肝脏内胆汁酸合成关键酶CYP7A1(cholesterol 7a-hydroxylase)、CYP27A1(sterol 27-hydroxylase)和CYP8B1 (sterol 12-alpha-hydroxylase)的蛋白表达水平,以及催化胆汁酸与氨基酸结合的关键酶BACS (bile acid-CoA synthetase)和BAAT (bile acid-CoA amino acid N-acetyltransferase)的蛋白表达水平；通过RT-PCR技术检测胆汁酸肠肝循环通路上胆汁酸转运体(BSEP、NTCP、ASBT、 ILBP、OSTα)及FXR、SHP的mRNA表达水平。结果1.术后12周,DJB组大鼠肝脏胆汁酸合成关键酶CYP7A1的表达水平显著低于SHAM组(P<0.05); CYP27A1、CYP8B1的表达水平在SHAM组和DJB组之间无显著统计学差异(P>0.05)。2.术后12周,DJB组大鼠肝脏内催化胆汁酸与氨基酸结合的关键酶BACS和BAAT的表达水平显著高于SHAM组(P<0.05)。3.术后12周,DJB组大鼠肝细胞表面胆汁酸转运体NTCP和BSEP的nRNA表达水平与SHAM组无差别(P>0.05)；回肠粘膜细胞胆汁酸转运体ASBT、ILBP及OSTα的表达水平显著高于SHAM组(P<0.05)。4.术后12周,DJB组大鼠肝脏内FXR的mRNA表达水平与SHAM组无显著统计学差异(P>0.05),但SHP的mRNA表达水平显著高于SHAM组(P<0.05)。在远端回肠,DJB组大鼠FXR的mRNA表达水平显著低于SHAM组(P<0.05),两组间SHP的mRNA表达水平无显著统计学差异(P>0.05)。结论1.DJB术后,T2DM大鼠肝脏内胆汁酸合成关键酶CYP7A1的表达下降,回肠粘膜细胞内ASBT、ILBP及OSTα的mRNA表达上升,说明DJB术后大鼠胆汁酸合成减少,血清总胆汁酸水平上升是肠道内胆汁酸重吸收增加的结果。2.DJB术后,T2DM大鼠肝细胞内影响胆汁酸与氨基酸结合的关键酶BACS及BAAT的表达上升,说明DJB术后大鼠体内牛磺酸与胆汁酸的结合更加活跃。3.DJB术后,T2DM大鼠肝脏FXR和SHP的mRNA表达均有上升趋势,而回肠FXR的mRNA表达下降,SHP无明显变化。说明胆汁酸合成减少可能是肝脏"FXR-SHP"通路被激活、负反馈调节的结果。4.DJB对大鼠肝脏FXR和回肠FXR的作用不同,提示肝脏和肠道内的胆汁酸谱可能存在显著差异。