溶瘤病毒疗法是一种新型的使用可复制的病毒选择性靶向肿瘤细胞并杀死肿瘤细胞的新策略。这种病毒天然的或者经过基因工程改造以后,能够选择性杀伤肿瘤细胞,而对正常细胞没有影响。溶瘤病毒疗法在去年取得突破性进展,Talimogene laherparepvec(T-Vec),一种单纯疱疹病毒经过基因改造后连接上粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF),三期临床实验展示了对黑色素瘤病人的良好反应性,并且获得了美国FDA的批准。还有其它一些病毒在基因改造前或后,例如牛痘病毒、腺病毒、水疱性口炎病毒、呼肠弧病毒,也被用来选择性靶向肿瘤细胞并展示了抗肿瘤效应。甲病毒M1由研究者于1964年从中国海南岛库蚊属蚊虫中分离得到。甲病毒M1属于披膜病毒科甲病毒属盖塔样病毒(Getah-like virus),单股正链RNA病毒,其基因组大小为11,696 nt。此前,我们的研究团队发现甲病毒M1能选择性靶向锌指抗病毒蛋白(ZAP)缺陷的肿瘤细胞,复制并通过引起剧烈的、长时程的内质网应激而杀死肿瘤细胞。然而,依然存在许多的肿瘤细胞对M1展示了一般的或较低的敏感性。不同肿瘤细胞较大的敏感性差异驱使我们对其机制深入详细的研究,从而寻求安全有效地对抗肿瘤的方法。在本研究中,我们探索了环磷酸腺苷通路对溶瘤病毒M1的体内外的抗肿瘤效应的影响。机制研究发现,环磷酸腺苷通路激动剂抑制肿瘤内M1诱导的抗病毒反应,促进病毒的复制。在体内外实验中,环磷酸腺苷信号通路激动剂展示了肿瘤特异并显著的增加溶瘤病毒M1的抗肿瘤谱的潜力。这些结果表明,环磷酸腺苷通路激动剂既可以用来直接增强M1的效应,也可以作为肿瘤内病毒被抗病毒因子对抗后的复燃剂。方法与结果:1.溶瘤病毒M1不同程度抑制肿瘤细胞的生长。方法:培养人癌症细胞系,永生化的上皮细胞系和原代分离的正常细胞;四甲基偶氮唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)分析法检测细胞生存率。相差显微镜观察M1感染前后的细胞形态;TCID50检测病毒的滴度。结果:我们发现M1病毒可以抑制许多肿瘤细胞的生长,然而不同的癌症细胞对M1病毒的敏感性是有差异的。并且,对M1病毒敏感的细胞具有较高的病毒复制。2.M1感染在低敏感的肿瘤细胞中诱导了许多抗病毒因子的表达,然而cAMP通路激活可以取消这种诱导的因子表达。方法:实时定量PCR用来检测M1感染前后,以及环磷酸腺苷通路激动剂处理前后,细胞内抗病毒因子的表达情况。Western blot用来检测病毒蛋白E1的表达。结果:M1感染在低敏感的肿瘤细胞中诱导抗病毒因子的表达。环磷酸腺苷通路激动剂可以抑制这种诱导的抗病毒因子的表达。并且,环磷酸腺苷通路激动剂可以取消干扰素对抗M1复制的作用。3.激活cAMP通路协同M1病毒杀死低敏感的肿瘤细胞。方法:MTT分析法用来检测一系列肿瘤细胞在db-cAMP处理和M1感染前后细胞的生存率状况。TCID50法用来测定不同处理因素后病毒滴度的情况。Werstern blot用来检测病毒的结构蛋白E1和非结构蛋白NS3的表达。结果:M1感染本身不影响肿瘤细胞HCT-116、Capan-1和正常细胞L-02的细胞生存率。环磷酸腺苷通路激动剂在许多肿瘤细胞增强M1的溶瘤效应,但是环磷酸腺苷通路激动剂/M1联合处理不影响正常细胞的细胞生存率。并且,环磷酸腺苷通路激动剂选择性在肿瘤细胞中增加病毒蛋白的表达和病毒的滴度。4.增强的溶瘤效应是由长时程的严重的内质网应激介导的。方法:透射电子显微镜用来观察不同处理因素后细胞内细胞器的形态改变。Western blot用来检测内质网应激标志物和内质网应激介导的凋亡通路。Caspase活性检测试剂盒用来检测Capspase-3/7/9的剪切酶活性。结果:我们观察到了M1/db-cAMP联合处理显著的诱导了内质网的肿胀,提示诱导了内质网应激。进一步,我们发现M1/db-cAMP联合处理显著的上调了内质网应激的标志物Bip、IRE1α、PERK和磷酸化的e IF2α表达。并且内质网介导的凋亡通路JNK通路和CHOP通路都在联合处理后显著地激活,从而表明了凋亡的发生。但是Caspase-12通路并没有显著地被激活,提示这条通路在M1/db-cAMP联合处理诱导的细胞凋亡中没有发挥重要的作用。5.Epac1是增强的溶瘤效应所必须的。方法:在肿瘤细胞中转染si RNA以敲低PKA催化亚基α和Epac1的表达,乱序si RNA作为对照。Western blot用来观测PKAcα和Epac1以及病毒蛋白E1的表达。MTT分析法用来检测细胞的生存率。TCID50用来检测病毒的滴度。结果:在肿瘤细胞中,我们发现敲低PKAcα并不影响M1/db-cAMP联合处理后的细胞生存率。然而敲低Epac1废除了环磷酸腺苷激活增强的溶瘤效应和增加的病毒复制。为了进一步确定此结果,我们采用了Epac1特异的抑制剂ESI-09,发现它可以取消环磷酸腺苷通路激活增强的溶瘤效应,增加的病毒蛋白表达和病毒的复制。6.cAMP通路激活在动物体内促进病毒的复制,抑制肿瘤的生长。方法:在裸鼠皮下注射Hep3B、HCT-116和Capan-1癌症细胞建立动物模型,用来观察环磷酸腺苷类似物联合M1处理后对肿瘤生长的影响。肿瘤组织分离出来用来观察肿瘤的尺寸和更进一步的免疫组化染色。实时定量PCR用来检测动物体内的病毒基因组RNA,从而观察体内病毒的复制情况。免疫组化用来观察肿瘤组织内增殖指标Ki-67和凋亡指标剪切体的Caspase-3。结果:我们观察到8-CPT-cAMP/M1联合处理显著地抑制了体内肿瘤的生长。8-CPT-cAMP处理特异性地在肿瘤内上调了病毒基因组RNA。免疫组化染色表明8-CPT-cAMP/M1联合处理下调了肿瘤内增殖指标Ki-67和上调了肿瘤内凋亡指标剪切体的Caspase-3。7.cAMP通路激活在人原代癌组织中增强M1病毒的溶瘤效应。方法:离体活癌组织培养法(ex vivo)检测M1/cAMP联合处理后的抗肿瘤效应。结果:M1/cAMP联合处理在四个标本中的三个中展示了显著地抗肿瘤效应。结论:1.M1在大量的肿瘤细胞中展示了抗肿瘤效应,但是在不同的肿瘤细胞中敏感性和病毒的复制水平具有较大差异。2.针对低敏感的细胞,我们发现M1病毒感染时间依赖性地诱导抗病毒因子的表达,从而提示抑制抗病毒因子的表达可以增加M1的抗肿瘤效应。进一步,我们发现cAMP通路激动剂抑制这种诱导的抗病毒因子的表达。3.在低敏感的肿瘤细胞中,cAMP通路激动剂增强M1的溶瘤效应,增加M1病毒的复制。但是不在正常细胞增加病毒的复制。提示cAMP通路激活可以作为溶瘤病毒M1治疗过程的复燃剂。4.增加的溶瘤效应是由于不可逆的内质网应激引起的。内质网应激凋亡通路JNK和CHOP通路激活引起了细胞的死亡,而Caspase-12通路没有被激活。5.增加的溶瘤效应不是cAMP通路的经典激酶PKA介导的,而是由鸟苷酸交换因子Epac1介导的。6.M1/cAMP联合处理在动物体内抑制肿瘤的生长,展示了更少的Ki-67表达和更多的剪切体Caspase-3表达。并且,cAMP通路激活特异的在肿瘤内增加病毒的复制。7.M1/cAMP联合处理在离体活组织中抑制肿瘤组织的生长,表明了这种联合处理具有增加溶瘤病毒M1的抗肿瘤效应和抗肿瘤谱作用。