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营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins，VIPs)是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thruingiensis，Bt)在对数生长中期分泌的一类新型杀虫毒蛋白，它对鳞翅目昆虫具有较广谱的杀虫活性。Vip3A蛋白通过诱发细胞凋亡，最终导致昆虫死亡，这种作用机理与Bt杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)的作用机理完全不同。本文对实验室保存的菌株进行vip3A基因的检测，克隆了vip3A—WB5基因并在大肠杆菌中得到高效表达。应用生物信息学对vip3A—WB5基因的序列进行了分析。将vip3A—WB5基因导入具有防病、内生和促生功能的野生枯草芽孢杆菌中，构建了多功能工程菌。 用PCR方法对本室保存的菌株筛选获得30株含有vip3A基因。从中挑选对夜蛾科(Noctuidae)害虫具有较高毒力的WB5菌株，进行vip3A基因的克隆和测序。克隆得到的vip3A-WB5基因序列翻译为Vip3A-WB5蛋白一级序列，基因编码789个氨基酸残基。将Vip3A-WB5蛋白的氨基酸序列利用在线的Blast软件进行同源性分析。结果表明，该蛋白与已报道的8个Vip3A蛋白同源性达90％以上，与其它蛋白无同源性。应用NCBI的在线软件(NCBI Conserved Domain Search)分析表明，Vip3A-WB5蛋白具有CBM—4—9功能区，这是一个糖结合位点，这个结合位点与其作用机理密切相关。通过TMHMM2.0(http://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)分析表明，Vip3A-WB5蛋白具有信号肽，是一种跨膜蛋白。在线软件PredictProtein分析表明，Vip3A-WB5蛋白的二级结构中28.96％为螺旋结构，25.69％为折叠结构，45.35％为成环结构，经预测整个蛋白的三维结构呈紧密的球状。 将克隆的vip3A—WB5基因插入表达载体pET29a(+)，构建重组表达质粒pETvip-WB5，将其转化到大肠杆菌BL21，经1mmol／L IPTG诱导表达89kDa大小的Vip3A蛋白。将Vip3A蛋白对斜纹夜蛾的2龄幼虫进行生物测定，结果表明具有较高的杀虫活性。蛋白可溶性试验表明，目的蛋白大部分可溶，透射电镜观察无包含体存在，其原因有待进一步研究。在自然条件下进行了目的蛋白的纯化，并将纯化的蛋白对家兔进行免疫而制备多克隆抗体。福建农林大学博士学位论文 将克隆的v加划一WBS基因插入枯草芽抱杆菌的分泌型表达载体pus186，构建重组分泌型表达质粒pUS186vip一wBS，将其转化到具防病、内生和促生的野生型枯草芽抱杆菌BSZ中。对工程菌、WBS和BsZ室内抑菌、内生和促生作用的实验表明:工程菌和BsZ抑菌活性相当，WBS无抑菌作用;工程菌和BSZ能在白菜体内内生定殖，WBS无内生作用;工程菌、WBS和BSZ菌液浸种白菜15d后鲜重分别增加155.89%、158.54%和145.27%，对白菜苗都具有促生作用，苏云金芽抱杆菌WBS对白菜苗具有促生作用这是一个新发现，有待进一步证实。以上结果表明，将重组分泌型表达质粒pUs 1 86vip一WBS导入野生型枯草芽抱杆菌BSZ中，并未使其抑菌、内生和促生功能发生改变。