卵泡刺激素和黄体生成素是由垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种激素,成分为糖蛋白,两者统称为促性腺激素,具有促进卵泡发育成熟、促进雌激素分泌的作用,进而调控与生殖相关的一系列生理过程。卵泡刺激素和黄体生成素必须与其相应受体结合才能发挥生理作用,促性腺激素与其受体蛋白的结合将导致后者的构象变化。促性腺激素受体蛋白是一种跨膜蛋白,如果其在跨越细胞膜前结构就发生了变化,那么在跨膜完成后,在细胞膜内其结构也会发生变化,改变促性腺激素与促性腺激素受体G蛋白的结合途径,同时在其它旁蛋白的作用下,在此基础上激活环磷酸腺苷等第二信使,完成信号传递,调控蛋白表达和细胞生长过程。为了阐明甘加藏羊发情周期输卵管和子宫组织中卵泡刺激素受体和黄体生成素受体在生殖活动中的作用。本实验对甘加藏羊发情周期输卵管和子宫组织中FSHR和LHR阳性细胞的分布、FSHR mRNA和LHR mRNA基因的表达进行了研究。实验选取年龄2.5~3.5岁,发育正常处于发情周期健康未孕甘加藏羊32只,根据四分法将甘加藏羊分为4组:发情前期、发情期、发情后期、间情期,每组8只。在发情周期的不同阶段采集甘加藏羊的输卵管和子宫组织。(1)应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术,分别以GAPDH和β-actin为内参基因,对甘加藏羊发情周期输卵管和子宫中FSHR mRNA和LHR mRNA基因的表达规律进行研究。(2)采用HE染色法观察甘加藏羊发情周期各阶段输卵管和子宫组织结构变化特点。(3)应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法,结合计算机图像分析软件(Image pro-plus),对甘加藏羊发情周期各个时期输卵管和子宫中FSHR和LHR阳性细胞的分布规律及FSHR和LHR免疫反应阳性产物的积分光密度(表达量)进行了分析研究。研究结果如下:1.甘加藏羊整个发情周期输卵管和子宫组织中均有FSHR mRNA和LHR mRNA表达,呈现出一种动态的变化趋势:(1)甘加藏羊发情前期、发情期、发情后期和间情期输卵管组织中FSHR mRNA的相对表达量分别为0.98±1.39、1.55±0.87、0.25±0.17、1±0.65,其中发情期相对表达量最高,极显著高于发情后期(P<0.01),与发情前期和间情期差异显著(P<0.05);在输卵管组织中四个时期LHR mRNA的相对表达量分别为1.44±0.02、1.89±0.03、0.60±0.75、1±0.45,其中在发情期表达量最高,极显著高于发情后期(P<0.01),显著高于发情前期和间情期(P<0.05)。(2)甘加藏羊发情前期、发情期、发情后期和间情期子宫组织中FSHR mRNA的相对表达量分别为0.11±0.03、1.12±0.21、0.40±0.20、1±0.2,其中在发情期表达量最高,极显著高于发情前期和发情后期(P<0.01);在子宫组织中四个时期的LHR mRNA相对表达量分别为0.57±0.01、0.35±0.01、0.75±0.01、1±0.11,其中间情期表达量最高,极显著高于发情期(P<0.01),显著高于发情前期(P<0.05)。2.免疫组织化学检测结果显示:(1)甘加藏羊发情周期输卵管漏斗部、壶腹部和狭部均有FSHR和LHR阳性细胞分布,且主要分布在黏膜上皮和固有层细胞的细胞质中,颜色呈黄色或棕黄色。FSHR和LHR阳性细胞数量在发情前期、发情后期和间情期均在狭部分布最多,在发情期均在漏斗部分布最多。FSHR和LHR阳性细胞数量在整个发情周期在漏斗部黏膜上皮的分布均高于在漏斗部固有层中的分布;FSHR阳性细胞发情前期和间情期在壶腹部黏膜上皮的分布量最多,发情期和发情后期在壶腹部固有层中分布最多;LHR阳性细胞发情前期和间情期在壶腹部固有层中分布最多,发情期和发情后期在壶腹部黏膜上皮中分布最多;FSHR和LHR阳性细胞数量发情前期、发情期和间情期均在狭部固有层分布最多,发情后期均在狭部黏膜上皮分布最多。应用计算机图像分析软件(IPP)得出,FSHR蛋白在漏斗部黏膜上皮和固有层均在间情期表达量最高,LHR蛋白在漏斗部黏膜上皮和固有层均在发情期表达量最高。FSHR蛋白在壶腹部黏膜上皮中的表达量间情期最高,在壶腹部固有层中的表达量发情后期最高;LHR蛋白在壶腹部黏膜上皮细胞中的表达量发情期最高,在壶腹部固有层细胞中的表达量发情前期最高。FSHR蛋白在狭部黏膜上皮和固有层中的表达量均在发情后期最高;LHR蛋白在狭部黏膜上皮细胞中的表达量发情后期最高,在固有层中的表达量发情前期最高。(2)甘加藏羊发情周期子宫的子宫颈、子宫体、子宫角中均有FSHR和LHR阳性细胞表达,主要分布在基质细胞、腺体细胞、血管内皮细胞和肌层平滑肌细胞的胞浆中,颜色呈黄色或棕黄色。FSHR阳性细胞数量在发情前期和发情期均在子宫颈分布最多在发情后期和间情期均在子宫体分布最多;LHR阳性细胞数量在发情前期和发情期均在子宫体中分布最多,在发情后期在子宫角中分布最多,间情期在子宫颈分布最多。FSHR阳性细胞发情前期和发情期在肌层平滑肌细胞分布最多,细胞多为长条形,发情后期和间情期在基质细胞分布最多,细胞多为圆形;LHR阳性细胞发情前期在肌层平滑肌细胞中分布最多,细胞多为长条形,发情期、发情后期和间情期在基质细胞分布最多,细胞多为圆形。应用计算机图像分析软件(IPP)得出,FSHR蛋白在基质细胞、腺体细胞和肌层平滑肌细胞中的表达量均在发情期最高,在血管内皮细胞中的表达量间情期最高。LHR蛋白在基质细胞、腺体细胞和肌层平滑肌细胞中表达量均在间情期最高,在血管内皮细胞中表达量发情后期最高。结论:(1)甘加藏羊发情周期输卵管中FSHR mRNA和LHR mRNA表达量均在发情期最高,发情后期最低;(2)子宫中FSHR mRNA表达量发情期最高,发情前期最低,LHR mRNA表达量间情期最高,发情期最低。(3)甘加藏羊整个发情周期输卵管漏斗部、壶腹部和狭部均有FSHR和LHR阳性细胞分布,FSHR和LHR阳性细胞数量在发情前期、发情后期和间情期均在狭部分布最多,在发情期均在漏斗部分布最多,主要分布在黏膜上皮和固有层细胞的细胞质中。(4)甘加藏羊整个发情周期子宫的子宫颈、子宫体、子宫角中均有FSHR和LHR阳性细胞表达,FSHR阳性细胞数量在发情前期和发情期均在子宫颈分布最多,在发情后期和间情期均在子宫体分布最多;LHR阳性细胞数量在发情前期和发情期均在子宫体中分布最多,在发情后期在子宫角中分布最多,间情期在子宫颈分布最多,主要分布在基质细胞、腺体细胞、血管内皮细胞和肌层平滑肌细胞的胞浆中。该研究揭示了甘加藏羊发情周期输卵管、子宫组织中FSHR和LHR的分布、FSHR mRNA和LHR mRNA基因的表达。结果可为进一步探讨GTH及其受体对甘加藏羊发情周期输卵管、子宫功能活动、生殖调控等繁殖生理活动的作用,提供包括分子和细胞水平的试验数据。为研究雌性哺乳动物生殖内分泌调控,提高动物生产性能等提供科学的理论依据。