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背景与目的根据WHO(2008)分类中的定义,将同时具有Myc和Bcl-2或Bcl-6基因易位的B细胞淋巴瘤称为双打击淋巴瘤(Double Hit lymphoma,DHL),并且将同时具有三者基因易位的称为三重打击淋巴瘤(Triple-hit lymphoma,THL)。另一种B细胞淋巴瘤通过免疫组织化学方法检测出同时具有MYC和BCL-2或BCL-6蛋白高表达,这类淋巴瘤称为双表达淋巴瘤(Double-expression lymphoma,DEL)。近年来,很多研究找寻MYC和BCL-2/BCL-6阳性表达的免疫组织化学最佳判断阈值,通过免疫组织化学蛋白表达筛选基因易位,以确定在日常实践中有风险的患者需通过FISH检测。本研究通过FISH及IHC方法检测实验组中DLBCL(Diffuse large B cell lymphoma)的Myc、Bcl-2、Bcl-6易位情况及相应蛋白的表达情况,得出双打击淋巴瘤与双表达淋巴瘤的临床及病理特征,探讨两者的联系并探讨其预后特征及诊治方案。方法1.收集资料:收集郑州大学第一附属医院2010年至2015年确诊为DLBCL患者的石蜡包埋组织标本,经本科室两位资深淋巴瘤医师重新阅片诊断,并筛选出应用CHOP方案或者R-CHOP方案的患者65例,组织微阵列技术(tissuemicroarray TMA)将65例标本制成组织芯片。2.整理资料:对筛选出来的65例DLBLC患者的临床资料和病理资料进行回顾性分析,并且对患者进行电话随访。3.免疫荧光原位杂交:使用Vysis LSI MYC双色,断裂重排探针,Vysis LSI BCL6双色,断裂重排探针和Vysis LSI IGH/BCL2双重融合易位探针(Abbott Molecular,Abbott Park,IL)。使用配备有DP72照相机和DP2-BSW软件(Olympus,Tokyo,Japan)的荧光显微镜(Olympus BX51,Tokyo,Japan)分析FISH信号。4.免疫组织化学:检测MYC、BCL-2、BCL-6、CD10、MUM-1、Ki-67蛋白的表达情况。5.统计分析:使用SPSS 17.0统计软件统计分析。Pearson卡方检验,连续性校正和Spearman秩相关分析用于确定变量之间的关联和相关性。使用Kaplan-Meier曲线绘制生存分析并使用对数秩检验进行比较。通过Cox比例风险回归模型分析单变量和多变量生存分析。当双侧P<0.05时,结果被认为具有统计学意义。结果1.临床资料及随访:65例患者,其中男34例,女31例,男女性别之比为1.1:1,年龄4-81岁,平均年龄50.8岁,中位年龄为60岁。此组患者的Ann Arbor分期为:I期21例,Ⅱ期29例,Ⅲ期10例,Ⅳ期5例。根据上述相关指标计算患者的IPI评分,其中低危者32例,低/中危者18例,中/高危者10例,高危者5例。36例患者应用CHOP方案(环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松),29例患者使用利妥昔单抗的R-CHOP方案,随访2至80个月,生存34例,死亡31例。2.FISH结果:在所检测的65例DLBLC中Myc基因易位病例(14/65)占DLBCL的21.5%;Bcl-2基因易位病例占18.5%(12/65);Bcl-6基因易位占27.7%(18/65);BCL-2/IGH基因易位病例占18.5%(12/65)。7例(10.8%)肿瘤样品中Myc基因重排是唯一的易位。检测出6例DHL。其中4例(6.1%)具有Myc和Bcl-2基因易位,2例(3.1%)Myc和Bcl-6基因易位。9例(13.8%)Bcl-2和Bcl-6的同时易位。1例(1.5%)中检测到Myc、Bcl-2,Bcl-6基因的三重易位。3.免疫组化结果:65例DLBCL中GCB病例16例,NON-GCB病例46例;在Myc基因易位病例中GCB占27.6%(3/16),NON-GCB占68.8%(11/16);在Bcl-2/Ig H基因易位病例中GCB占26.3%(6/12),NON-GCB占41.7%(5/12),在Bcl-6基因易位病例中GCB占33.3%(4/120,NON-GCB占58.3%(7/12)。6例DHL患者中GCB占16.7%(1/6),NON-GCB占83.3%(5/6)。一例THL为NON-GCB。在所检测的65例DLBCL中MYC蛋白,BCL-2蛋白,BCL-6蛋白的表达情况。显示33例(50.1%)MYC蛋白高表达,32例(49.2%)显示BCL-2蛋白高表达,18例(27.7%)显示BCL-6蛋白高表达。我们使用ROC曲线分析来确定百分比的最佳截止值的蛋白阳性细胞。MYC,BCL-2和BCL-6的最佳临界值为≥50%,≥60%(等于预定阈值)和≥20%。Myc易位阳性病例(14例)中13例患者具有MYC蛋白高表达,特异性为90%。Bcl-2易位阳性病例(12例)有7例患者具有BCL-2蛋白高表达,特异性为58%。Bcl-2易位阳性病例(18例)有11例患者具有BCL-62蛋白高表达,特异性为61%。4.预后分析:6位DHL患者中的3例使用R-CHOP方案治疗,3例使用CHOP方案治疗,两组之间生存率并没有特异性。6例DHL患者全部死亡,生存期2-19个月,预后极差。1例THL生存8个月。与MYC易位相反,BCL-2或BCL-6基因的断裂并不能预测患者的OS和PFS。在CHOP和R-CHOP队列中分别评估了候选的预后因素。生存曲线显示MYC蛋白高表达在CHOP和R-CHOP组中与劣质OS显着相关。在CHOP队列中,BCL-2高蛋白表达与不良OS显着单独相关,但是不在R-CHOP队列中。然而,BCL-6蛋白高表达在R-CHOP队列中是不良预后因素,但是不在CHOP队列中。接下来我们分析DHS和THS对两个治疗组中的DLBCL患者的预后影响。在单变量分析中,在CHOP和R-CHOP组中,MYC/BCL-2蛋白高表达,MYC/BCL-6蛋白高表达和MYC,BCL-2和BCL-6三高蛋白表达都与不良OS相关。在R-CHOP队列中,当共表达MYC蛋白时,BCL-2高蛋白表达仅与较差的OS相关。BCL-2/BCL-6高表达显示有限的预后影响。在CHOP队列中,并入IPI,免疫组织化学分组(GCB对NON-GCB),MYC,BCL-2和BCL-6蛋白的多变量Cox回归模型显示IPI,高MYC蛋白表达和高BCL2蛋白表达,MYC/BCL-2高蛋白表达,MYC/BCL-6高蛋白表达,BCL-2/BCL-6高蛋白表达和三高蛋白表达独立影响OS的预后值。在R-CHOP队列中,并入IPI,MYC,BCL-2和BCL-6蛋白的多变量Cox回归模型显示:高MYC蛋白表达,高MYC/BCL-2 DHS,高MYC/BCL6 DHS和高THS对于不良OS和PFS具有独立的预后价值。高BCL2/BCL6 DHS同样也是独立的预后值。两组治疗方案患者的Cox模型显示,MYC高蛋白表达显示与Myc基因断裂没有相关性,BCL-6高蛋白表达显示与Bcl-6断裂没有相关性,BCL-2高蛋白表达显示与IGH/Bcl-2融合没有相关性。并入变量Myc断裂与DHS的Cox模型显示,IHC组或FISH组模型中的队列可以代表整个DHL患者人群并没有统计学意义。结论1.DHL与DEL患者具有高LDH水平,临床分期多为Ⅲ-Ⅳ期,多个结外部位的侵及,和高IPI评分的临床病理特征。2.对于MYC,BCL-2和BCL-6蛋白表达,具有50%,60%和20%的最佳Cut-Off值预测了通过FISH在DLBCL中检测到的Myc断裂,最终我们检测到的Myc断裂存在高特异性(90%),但是IGH/Bcl-2融合和Bcl-6断裂的并未发现高特异性。3.DHL患者的CHOP与R-CHOP方案并不能有效改善患者预后。