论文部分内容阅读
目的通过免疫荧光技术、免疫共沉淀技术及GST pulldown技术,研究CLIC3蛋白与Sedlin蛋白之间是否存在相互作用：构建pcDNA3.1-CLIC3-FLAG及pCDGFP-CLIC3重组质粒,分别转染到COS7细胞中,观察CLIC3蛋白的分布状况。构建pcDNA3.1-CLIC3-HA重组质粒与GST-Sedlin融合蛋白共同作用,通过GSTpulldown技术检测CLIC3与Sedlin蛋白在体外的相互作用情况。通过免疫共沉淀方法检测CLIC3与Sedlin蛋白在哺乳动物细胞内的相互作用情况。方法以含人CLIC3全长的cDNA序列为模板,分别设计合成了下游带FLAG和HA标签的引物并将CLIC3基因构建到pCDGFP和pGEX-5X-3载体上,经由PCR方法扩增目的片段,扩增出的目的基因经双酶切后连接到相应的载体上,重组质粒经转化、DNA抽提及酶切鉴定后正确的克隆进行测序。测序正确后的质粒用于抽提高纯度的重组质粒。采用脂质体转染法将质粒pcDNA3.1-CLIC3-FLAG及pCDGFP-CLIC3分别转染至COS7细胞及将pcDNA3.1-CLIC3-FLAG和pCDGFP-Sedlin以及pcDNA3.1-FLAG-Sedlin和pCDGFP-CLIC3两组质粒分别共同转染至COS7细胞中,通过免疫荧光制片及荧光显微镜观察CLIC3在COS7细胞中的表达和定位以及CLIC3和Sedlin在COS7细胞中的共定位情况。采用脂质体转染法将pcDNA3.1-CLIC3-FLAG和pCDGFP-Sedlin共同转染如HEK-293T细胞中,通过Western blot检测CLIC3蛋白能否将Sedlin蛋白沉淀下来。以此来验证在哺乳动物细胞中CLIC3蛋白与Sedlin蛋白的相互作用情况。制备GST-CLIC3融合蛋白及GST-Sedlin融合蛋白,通过GST pulldown技术检测CLIC3蛋白与Sedlin蛋白在体外相互作用的情况。结果酶切鉴定及测序结果都说明各重组质粒构建成功。pcDNA3.1-CLIC3-FLAG及pCDGFP-CLIC3单转免疫荧光结果表明,在COS7细胞中外源CLIC3大量分布,且在细胞质与细胞核中均有表达,Sedlin蛋白在细胞质及细胞核中也均有表达,共定位实验观察到CLIC3与Sedlin蛋白在细胞质与细胞核内均匀共定位,其中在细胞质共定位更加明显。GST pulldown结果显示, CLIC3与Sedlin在体外存在相互作用。免疫共沉淀结果表明,在HEK-293T细胞中CLIC3与Sedlin存在相互作用。结论通过免疫荧光技术、免疫共沉淀分析及GST pulldown技术等实验证明了CLIC3蛋白与Sedlin蛋白在体外及细胞内都存在着相互作用。目的通过免疫荧光技术、GST pulldown技术研究CLIC4蛋白与Sedlin蛋白之间的相互研究：构建带FLAG标签的CLIC4真核表达载体及带GFP标签的CLIC4真核表达载体,分别转染至COS7细胞中,观察CLIC4蛋白分布状况。构建带HA标签的CLIC4真核表达载体与GST-Sedlin融合蛋白共同作用,通过GST pulldown技术检测CLIC4与Sedlin蛋白在酵母细胞中的相互作用情况。方法以含人CLIC4全长的cDNA序列的菌液为模板,分别设计下游带有FLAG、HA标签的引物和将CLIC4基因构建到PCDGFP和PGEX-5X-3载体上的引物,经PCR方法扩增目的片段,目的基因经双酶切后连接到相应的载体上,重组质粒经转化、DNA抽提及酶切鉴定后正确的克隆进行测序。测序正确后的质粒用于抽提高纯度的重组质粒。采用脂质体转染法将质粒pcDNA3.1-CLIC4-FLAG及pCDGFP-CLIC4分别转染至COS7细胞及将pcDNA3.1-CLIC4-FLAG和pCDGFP-Sedlin以及pcDNA3.1-FLAG-Sedlin和pCDGFP-CLIC4两组质粒分别共同转染至COS7细胞中,通过免疫荧光制片及荧光显微镜观察CLIC4在COS7细胞中的表达和定位以及CLIC4和Sedlin在COS7细胞中的共定位情况。制备GST-Sedlin融合蛋白,通过GST pulldown技术检测CLIC4蛋白与Sedlin蛋白在体外相互作用的情况。结果酶切鉴定及测序结果都说明各重组质粒构建成功(?)pcDNA3.1-CLIC4-FLAG及pCDGFP-CLIC4单转免疫荧光结果表明,在COS7细胞中外源CLIC4大量分布,且在细胞质与细胞核中均有表达,Sedlin蛋白在细胞质及细胞核中也均有表达,共定位实验观察到CLIC4与Sedlin蛋白在细胞质与细胞核内均匀共定位,其中在细胞质共定位更加明显。GST pulldown结果显示,CLIC4与Sedlin在体外存在相互作用。结论通过免疫荧光技术、GST pulldown技术等实验初步证明了CLIC4蛋白与Sedlin蛋白在体外及细胞内都存在着相互作用。