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细菌启动子是细菌中基因表达的重要调控元件,决定了细菌基因表达的强度和时机。在染色体上进行启动子的构建有利于解决在质粒上构建启动子的弊端:如质粒对宿主的负荷和不稳定性等。随着合成生物学和代谢工程的发展,对染色体上强启动子的需求日益增加,本研究将在大肠杆菌染色体上构建强启动子,包括组成型强启动子的构建和严谨型强启动子的构建这两个方面。人工启动子M1-37、M1-46和M1-93是课题组构建和筛选得到的组成型启动子;PrrnD是大肠杆菌核糖体rRNA的启动子,也是文献中常用的组成型启动子。将这四个组成型的启动子序列(M1-37、M1-46、M1-93和PrrnD)整合到染色体上,并用绿色荧光蛋白基因g思^的荧光表达强度进行了启动子表达强度评价。96孔酶标板(底透明黑板)荧光测定分析显示,相对于Plac启动子,M1-37、Ml-46、M1-93和PrmD的表达强度分别为1.5、1、2.67和5。PrrnD启动子表达强度最高。为得到更高强度的组成型启动子,我们从PrrnD启动子出发构建启动子RBS库调控元件,设计了新的强启动子筛选方案:将卡纳霉素抗性基因Km序列连接于报告基因gfp后,使和gfp受同一个启动子表达控制,利用高浓度的卡纳霉素和启动子强度的偶联关系,直接抗性压力筛选得到组成型强启动子。利用这一策略,我们从PrrnD的RBS启动子调控库中,筛选到强组成型启动子P10和P36,它们相对于PlacZ的强度分别为10和36倍,其中P36是强度最高的组成型启动子。基于四种调控元件:四环素tetO、乳糖lacO、阿拉伯糖araC和鼠李糖rhaR的序列,和两种来源的启动子PL和Plac序列,设计和组合构建了六个启动子Ptet02、Ptet03、PlacO2、Plac03、PlacO+ara 和 PlacO+rha。应用 CRISPR/Cas9 系统将这六个启动子序列整合到大肠杆菌染色体上,利用绿色荧光蛋白GFP的表达分析了这六个启动子的相对表达强度和严谨型控制情况。GFP表达分析显示,在无诱导剂诱导的情况下,启动子 Ptet02、Ptet03、Plac02、Plac03、PlacO+ara 和 PlacO+rha 的表达强度分别为 0.02、0.02、0.84、0.77、0.6和0.02;在有诱导剂诱导的情况下,它们的表达强度分别为4.5、3.7、0.97、0.82、6和12。其中,PlacO+rha为最佳严谨型启动子,在无诱导剂时其表达强度为PlacZ的0.02倍,有诱导剂时其表达强度为PlacZ启动子的12倍,相对表达控制范围为600倍。本研究获得的组成型强启动子P36和严谨型强启动子PlacO+rha将为代谢工程和合成生物学中的精确调控基因表达奠定良好的应用基础。