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聚酮类抗生素美达霉素(medermycin)是链霉菌AM-7161(Streptomyces sp.AM-7161)的次生代谢产物,具有抗革兰氏阳性菌及多种肿瘤的生物学活性。美达霉素生物合成基因簇中存在几个可能的调控基因,如medd-ORF11和med-ORF10可能都参与美达霉素的合成正调控;而med-ORF9可能编码参与吡喃环成环的烯酰还原酶。本研究利用遗传学及分子生物学技术在美达霉素野生型产生菌链霉菌AM-7161中对这些基因的功能展开初步分析,具体内容包括以下几方面:一、关于正调控基因med-ORF11同源性分析揭示med-ORF11属于链霉菌抗生素调控因子蛋白(Streptomyces antibiotic regulatory proteins,SARPs)家族(SARPs家族是抗生素生物合成途径中广泛分布的正调控因子),所以推测med-ORF11通过正调控机制参与美达霉素生物合成,但其确切的功能及具体的调控机制尚未阐明。(1)在野生菌中超量表达med-ORF11本研究首先从美达霉素产生菌AM-7161基因组上克隆了 med-ORF11基因,测序正确后再克隆到链霉菌整合型表达载体pIJ8600上,获得了用于med-ORF11超表达的质粒,命名为pHSL49;通过接合转移将pHSL49导入链霉菌AM-7161中,经过抗性筛选和分子水平验证筛选出med-ORF11超量表达菌株。在R4产素平板上培养后,观察固体培养物的红褐色素的积累(代表美达霉素的产生),发现med-ORF11超量表达菌株产生美达霉素的能力较野生型链霉菌AM-7161略高,说明med-ORF11的功能与文献推测相符,初步表明了 med-ORF11在美达霉素生物合成中起正向的调控作用。(2)在野生菌中敲除medd-ORF11将med-ORF11上游的同源左臂和下游的同源右臂连接后克隆到具有遗传不稳定性的pYH7载体上,构建了用于med-ORF11基因敲除的质粒pHSL47,通过接合转移将质粒pHSL47导入链霉菌AM-7161,经过松弛培养以及抗性验证及分子水平验证后,筛选出med-ORF11敲除突变菌株。首先在R4固体产素培养基上固体培养。结果表明med-ORF11突变菌株产素能力较野生型链霉菌AM-7161大大降低(根据美达霉素特征性红褐色);然后进行液体发酵。HPLC分析液体发酵上清液中的美达霉素的积累情况,也发现med-ORF11敲除突变菌株中,美达霉素积累水平下降。结合基因敲除和超表达实验表明med-ORF11是一个参与美达霉素生物合成的正向调控基因。二、关于正调控基因medd-ORF10前期发现medd-ORF10参与美达霉素生物合成调控,机制未知;根据对同源基因actVI-ORFA研究推测及部分实验证明med-ORF10可以调控同一基因簇中的med-ORF12(编码酮基还原酶,参与吡喃环手性结构的形成)的表达。但med-ORF10是否可以作用于靶基因med-ORF12的启动子(Pmed-ORF12)还未曾阐明。(3)在异源宿主BL21(DE3)中构建双质粒系统验证Med-ORF10与靶基因medd-ORF12启动子的关系本研究将含有med-ORF12的可能的启动子区域(Pmed-oRF12)的启动子探针质粒pHSL33导入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用Wetern blot可以检测到位于(Pmed-ORF12)下游的GFP基因的表达(尽管表达量很低),初步说明这个区域具有启动子活性,并且可以被大肠杆菌中的转录酶系识别。我们拟利用大肠杆菌中的双质粒系统来检测Med-ORF10是否可以作用(Pmed-ORF12):在大肠杆菌BL21(DE3)中导入含有med-ORF10的表达质粒pHSL79(衍生于表达载体pET28a(+);前期实验证明Med-ORF10可以在这个系统下有效表达),然后将含有Pmed-ORF12的启动子探针质粒pHSL33导入BL21(DE3)/pHSL79中。这两个衍生质粒携带不同抗性基因,理论上利用抗生素强制筛选可以保持二者共存。但我们发现两个质粒在双抗筛选条件下二者发生重组整合,说明在BL21(DE3)中不适合构建pHSL33和pHSL79的双质粒系统。三、烯酰还原酶基因medd-ORF9(4)med-ORF9序列分析首先在基因序列分析过程中发现AM-7161美达霉素基因簇中的med-ORF9与放线紫红素基因簇中的同源基因actVI-ORF2在N端序列差异较大,这种差异有可能导致med-ORF9的催化效率较低甚至没有功能。(5)构建同源基因actVI-ORF2高表达质粒鉴于美达霉素和放线紫红素聚酮母核的合成机制可能类似,我们拟用actVI-ORF2在AM-7161中进行种间表达,看是否可以与med-ORF9发生功能协同或者互补以提高美达霉素合成水平。所以从天蓝色链霉菌基因组上克隆了actVI-ORF2基因,构建了高表达质粒,体内功能验证在进行中。