论文部分内容阅读
研究背景与目的:肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是目前最常见的恶性肿瘤之一,为当今世界第三位致死性肿瘤,占我国肿瘤死因的第二位,全世界约有100万患者,每年约有30万新增病例。在新增的病例中,45%发生在中国,主要分布在东南及沿海流域。近年来,随着乙型肝炎病毒的流行,我国肝癌的地域分布及发病趋势发生明显变化。其发病年龄高峰移向青壮年,死亡率也向小年龄组推移。目前对肝细胞癌的治疗主要基于外科手术切除,切除后使用相关的化疗药物对肝细胞癌的作用非常有限,因此研究原癌基因对肝细胞癌增殖及侵袭的影响,对进一步干预治疗,有非常重要的意义。c-Kit是编码受体酪氨酸激酶家族的原癌基因。目前研究表明,c-Kit与多种肿瘤的发生、发展、预后都有着密切的联系,如胃肠道间质瘤、急性髓细胞白血病、肺癌等多种人类肿瘤组织中均存在c-Kit受体的异常表达。针对这些高表达c-Kit受体的肿瘤,应用酪氨酸激酶抑制剂治疗恶性肿瘤已经取得了一定的临床疗效。目前,肝细胞癌中c-Kit受体表达的研究,国内外鲜有报道,KIT/SCF信号通路究竟在肝细胞癌中起怎样的作用,需要深入研究。通过查阅文献,我们收集到以下信息:首先,c-Kit原癌基因的表达上调,在多种肿瘤中都提示患者预后较差;其次,c-Kit在正常肝脏中,仅出现在汇管区的部分卵圆细胞中,而在肿瘤中的分布并不均匀,有研究报道其表达可能在肝硬化-肝癌病程进程中发生变化;第三,KIT/SCF信号的下游的部分信号通路中的PI3K/AKT信号通路,与经典的Wnt通路有密切联系,而Wnt通路是肝细胞癌侵袭转移的重要途径之一。基于以上理论,我们得出假设:KIT/SCF信号通路被激活后,可能引起下游的信号通路发生相应变化,从而引起肝细胞癌的增殖及侵袭转移特性增强。本文重点是验证上述假设,探讨c-Kit对肝细胞癌增殖及侵袭性影响及其分子机制。材料与方法:1.通过免疫组化方法在89例临床肝细胞癌组织中检测c-Kit的表达,探讨其与各临床病理因素间的关联;在不同侵袭、转移潜能的同系肝癌细胞株MHCC-97L和MHCC-97H中,利用Realtime-PCR及Western-blot方法检测其c-Kit及Kit的基因和蛋白表达,以明确其与侵袭、转移能力的关系;2.利用Adeasy系统,构建c-Kit重组腺病毒载体,用其转染Hep-G2肝癌细胞,通过Western-blot、侵袭实验、运动实验、裸鼠成瘤实验等方法,观察过表达c-Kit对肝癌细胞侵袭、运动能力的影响;3.利用外源性的c-Kit受体的配体SCF添加入SMMC-7721肝癌细胞,观察c-Kit/SCF信号系统对对β-catenin分布情况的影响;并研究c-Kit/SCF信号系统对β-catenin分布情况的影响是否是通过PI3K/AKT信号系统实现的,以及研究在此过程中PI3K/AKT信号系统中关键因子AKT,GSK-3β磷酸化情况;4.通过免疫组化方法在89例临床肝细胞癌组织中检测FAK的表达,探讨其与各临床病理因素间的关联,并通过统计学分析明确FAK与c-Kit的相关性;利用免疫共沉淀的方法,检测SMMC-7721和Hep-G2肝癌细胞中FAK与KIT蛋白的结合情况。结果及结论:1.在临床HCC组织标本及不同侵袭、转移潜能的肝癌细胞中检测c-Kit表达,我们得出如下结果:1.1. c-Kit的表达在肝细胞癌中显著增高;1.2. c-Kit的表达程度与肿瘤TNM分期、血管侵袭、HBsAg和HBV DNA等临床病理因素均呈显著正相关,提示c-Kit表达与HCC的进展可能有密切关系,其表达随着肿瘤的进展而上调;1.3.在同系中分离出的不同侵袭、转移潜能的细胞株中,高侵袭、转移潜能的肝癌细胞株MHCC-97H中c-Kit的表达明显高于低侵袭、转移潜能的MHCC-97L,提示了c-Kit的表达随着肿瘤侵袭、转移能力的增强而上调;2.成功构建了携带c-Kit基因的重组腺病毒载体,并能够高效转染Hep-G2肝癌细胞,目的基因得到高表达;外源性转染c-Kit基因,可以提高Hep-G2肝癌细胞的侵袭、运动能力。3.当外源性的c-Kit受体的配体SCF添加入SMMC-7721肝癌细胞后,PI3K/AKT信号系统被激活,其关键因子AKT及GSK-3β发生明显的磷酸化,β-catenin分布明显向细胞核内转移,加入KIT/SCF信号通路的特异性抑制剂Imatinib后,β-catenin无法向细胞核内转移;4.在临床HCC组织标本及不同侵袭、转移潜能的肝癌细胞中检测FAK表达,并分析FAK与c-Kit的相关性;利用免疫共沉淀的方法,检测SMMC-7721肝癌细胞中FAK与KIT蛋白的结合情况。4.1. FAK的表达在肝细胞癌中明显增高;4.2. FAK的表达与血管侵袭、肿瘤TNM分期、HBsAg和HBV DNA水平等临床病理因素均呈显著正相关。提示FAK表达与HCC的进展有密切关系,其表达随着肿瘤的进展而上调;同时FAK与c-Kit的在肝癌细胞中的表达密切相关;综上所述,本研究主要结论如下:1. c-Kit基因在HCC中的表达与肿瘤的进展密切相关,其表达上调,暗示着肿瘤的预后不良;外源性转染c-Kit基因可增强HCC的侵袭、运动、成瘤能力。2. c-Kit基因是肝细胞癌中的重要基因,它可以通过激活PI3K/AKT信号通路,以及与FAK发生协同作用,增加HCC的侵袭性。3. KIT/SCF信号通路的抑制剂Imatinib可能对HCC的发生发展起到保护性的作用。4.KIT蛋白在肝癌细胞中,可以特异性结合FAK。