栽培南方红豆杉紫杉醇分析提取与指纹图谱研究

来源 :西南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:seraphim0113
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
南方红豆杉(taxus chinensis vaF.mairei),又称美丽红豆杉,为裸子植物门(Gymnospermae)红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)植物。为红豆杉属植物中分布最广泛的一种,主要分布于长江流域、南岭山脉山区及河南、陕西、甘肃、台湾等省的山区或溪谷,它是亚热带常绿阔叶林、常绿落叶阔叶混交林的特征种,常与其他阔叶树、竹类以及针叶树混生,分布于海拔800~1600米,资源储量相对较红豆杉其它各种多。自1971年从红豆杉中分离出紫杉醇后,它已成为研究抗肿瘤天然药物的重点,南方红豆杉更成为我国紫杉醇药物生产的主要树种。南方红豆杉中紫杉醇含量甚微,其含量范围仅仅在0.003%~0.008%之间,含有大量的植物腊、色素和树胶等杂质,特别是其中共存许多分子结构和理化性质与紫杉醇极其相近的紫杉烷系列化合物,而这些成分会严重干扰紫杉醇的反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定。为了能准确测定紫杉醇含量,试验优选了RP-HPLC测定紫杉醇含量的色谱条件,即:用SHIMADZU C18色谱柱(250mm×4.6mm ID,5μm);甲醇-水-乙腈(22:32.5:45.5)为流动相,紫外检测波长为227nm。紫杉醇对照品溶液浓度在0.0004376mg.mL-1~0.004376mg.mL-1范围内,线性方程为:Y=2.152968×107X+1773(r=0.9999)(n=5);相关系数r=0.9999(n=5)时,与峰面积线性关系良好;通过检测限(紫杉醇进样量为0.001050μg时)和定量限(紫杉醇进样量为0.003501μg时),确定了紫杉醇对照品溶液最小浓度也符合RP-HPLC的检测要求。对南方红豆杉人工林材样品制备优化处理如下:将采集的南方红豆杉整株样品干燥,用6倍量(W/V)的乙醇浸提两次,合并提取液,减压浓缩至干;再用6倍量(W/V)的二氯甲烷液液萃取三次,合并萃取液,减压浓缩至干,残渣加色谱甲醇溶解,制成南方红豆杉样品溶液;用加样回收方法考察了该方法的可行性。同时随机采集了10批南方红豆杉药材样品,进一步验证了建立的RP-HPLC检测紫杉醇含量方法的可行性,结果表明该方法快速、简便、可靠,重现性好,能作为人工种植南方红豆杉中紫杉醇含量检测方法。在对重庆市忠县的南方红豆杉人工林材各部位紫杉醇含量变化规律研究过程中,以紫杉醇含量为指标,采用正交试验,通过4因素5水平交表(L16(45)),对南方红豆杉影响因素年龄、季节(以随机选取各季节的一个月份作为代表)、不同部位3因素进行了优选试验。结果表明:南方红豆杉中紫杉醇含量主要影响因素是年龄,其次是不同部位,采收季节对紫杉醇的含量影响也是显著的;通过多重比较,确定T9(A3B1C4)效果最好,即在1月份时采用6年生人工种植南方红豆杉叶,为优化选出的紫杉醇最佳采集时机,再结合红豆杉生产实际情况,采集6年生的枝叶作为紫杉醇的试验对象。干燥方法对南方红豆杉中紫杉醇含量的影响研究中,采用自然风干、减压干燥和微波干燥3种干燥方法,综合各干燥方法中的不同干燥条件,试验结果表明:减压干燥宜选用60℃;微波干燥低火;而自然风干和其它干燥方法可能造成紫杉醇显著降解,均不宜取。优化并建立红豆杉枝叶中紫杉醇的提取工艺,充分考虑了工业化生产的可行性。以使用RP-HPLC测定的紫杉醇含量为指标,采用正交试验法对提取过程中乙醇浓度、乙醇用量、提取次数、提取时间4因素进行优选试验。结果表明:从红豆杉中提取紫杉醇的最主要影响因素是乙醇浓度及乙醇用量,高浓度、适当多的用量有利于提取;提取时间和次数也极为重要;单因素效果分别以每次提取2h和共提取2次为最佳。最终T9(A3B3C2D1)和T8(A3B2C1D3),即采用8倍量(W/V)95%乙醇提取2次,每次提取2小时,或采用6倍量(W/V)95%乙醇提取1次,提取4小时,均为优化选出的紫杉醇最佳提取工艺条件。在中药的开发过程中,色谱指纹图谱研究工作是国内中药现代化研究的热点之一,为中药材建立相应的指纹图谱是现阶段控制中药内在质量的有效手段。试验中共收集到人工种植南方红豆杉枝叶药材11批、研究过程中考察了色谱条件的优化,包括色谱柱、检测波长和流动相的优化选择;同时参照国家食品药品监督管理局对中药材指纹图谱的要求,对色谱条件进行了方法学验证,即仪器精密度试验、样品重复性和稳定性试验;在此基础上构建了色谱指纹图谱,包括:共有峰的标定、参照峰的选择、共有峰相对保留时间及积分相对比值的确定、非共有峰占总峰面积的百分比、共有峰的相似度计算,色谱条件的优化结果表明,选用C18柱,检测波长为227nm,以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱,为最佳色谱条件。根据色谱条件的优化结果,对仪器精密度、样品重复性和稳定性进行试验,高效液相色谱测定结果中,共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD都小于3.0%,表明采用高效液相色谱法进行色谱指纹图谱的研究是切实可行。通过色谱指纹图谱的构建,确定了17个共有峰,以9号峰作为参照峰;共有峰相对保留时间和相对峰面积的平均RSD都小于2.0%,说明试验结果可靠;共有峰面积百分比在4.1%~8.3%,符合指纹谱研究规定小于10%的检测要求;采用相关系数法和夹角余弦法对共有峰的相似度进行了计算,两种计算方法结果全图谱相似度均≥93%,表明所建立指纹图谱的技术指标稳定。选定的指纹图谱可对人工种植南方红豆杉枝叶药材组分群体特征的一致性作出可靠的判断。
其他文献
近年来,随着人们对环境保护认识的提高,全球自然保护区的数量有了很大的增长,管理有效性的提高也已被国内外各界人士所关注,而且在2003年德班世界公园大会上被列为未来十年内保护
学位
本文以甘肃省天水市引种的四倍体刺槐为研究对象,对不同栽培模式四倍体刺槐人工林的物候、生长状况及土壤含水量进行了调查和分析,结果表明:1.四倍体刺槐的冠幅、标准枝、基
非生物逆境胁迫是影响植物生长发育以及生物产量的主要因素之一,为适应环境植物形成了一套内在的自身调节机制,其中miRNA主要通过剪切降解靶基因或者抑制其翻译达到调控的目
电视民生新闻节目以民本思想为基点,用平民视角和人文叙事手法,表现普通百姓的生命、生存、生活与生计,在很多城市台中充当了提高收视率的“急先锋”。但我们也应该看到,民生
迄今为止,我国对于湿地生态旅游管理的研究还处于刚刚起步阶段,仅对湿地生态旅游管理中旅游开发管理、社区参与管理等方面开展了相关研究。对于湿地生态旅游管理还未见系统的研
学位
无尾两栖类是水生到陆生的过渡类群,在其生活史中需经历卵、蝌蚪和蛙三种形态。因其分和范围广,种类和数量较多,易采集等特征,一直是科研和教学的良好材料。掌握无尾两栖类的发育
学位
云南山茶(Camellia rettculata Lindl.)是我国的传统名花,在中国有着1300多年的栽培历史。其花朵硕大、花色艳丽、花型优美、花期持久、枝繁叶茂、四季常绿且品种众多,具有重要的
学位
湿地作为地球上水陆相互作用形成的独特生态系统,是自然界最富生物多样性的生态景观和人类最重要的生存环境之一,随着我国城镇化的步伐加快,大面积的湿地遭到了不同程度的破坏;大
本研究采用根钻法对毛乌素沙地中不同坡位条件下的沙柳林地样地的细根分布进行了连续取样调查分析,同时对土壤水分进行动态监测。采用2mm作为粗、细根的划分标准对土壤—根系