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本文主要从以下几方面展开论述： 第一部分 内质网应激及ASICla在大鼠椎间盘髓核中的表达 目的：探索大鼠椎间盘髓核组织中内质网应激和ASICla的表达及其与退变的关系。 方法：获取大鼠4周、8周、12周、24周、40周、60周共6个时间点大鼠脊柱正中冠状面切片。HE染色观察细胞成分及形态演变，阿利辛蓝、天狼星红染色观察软骨基质与纤维基质表达变化，马松染色观察肌纤维与胶原纤维表达变化。免疫组织化学染色观察ASICla、GRP78、XBPI、eIF2α、CHOP和Caspase12表达分布。8周SD大鼠穿刺诱导椎间盘退变，术后8周行MRI观察造模情况，Western blot、qRT-PCR比较正常及退变椎间盘髓核中ASICla、GRP78、XBP1、CHOP和Caspase12的表达情况。 结果：自然退变过程中，随年龄增长，椎间盘髓核中细胞数目逐渐减少，胶原纤维和蛋白多糖含量逐渐降低。自然退变过程中，内质网应激代表性指标GRP78、XBP1、p-eIF2α、CHOP和Caspase12在椎间盘髓核中均有表达。其中GRP78、XBP1和p-eIF2α在年轻椎间盘中表达较高，随退变进展表达逐渐降低。CHOP和Caspase12表达在年轻椎间盘表达较低，退变后表达较高，但严重退变后表达再次降低。ASICla表达在40周前呈现逐渐上升趋势，60周时表达明显下降。穿刺诱导退变的大鼠椎间盘髓核中，GRP78、XBPI和p-eIF2α表达降低，CHOP和ASIC1a表达增加，Capsase12表达无明显变化。 结论：1．内质网应激参与了大鼠椎间盘髓核退变过程，包括UPR反应相关指标和促凋亡通路指标在椎间盘髓核中均有表达，其中UPR的表达和髓核功能相关。2．ASIC1a在大鼠椎间盘髓核中表达，退变过程中ASIC1a的表达逐渐增加，严重退变的髓核组织中ASIC1a表达降低。 第二部分 酸诱导的大鼠NPCs损伤与内质网应激 目的：体外模拟椎间盘酸性环境，检测酸刺激对NPCs的影响，探索酸性环境中内质网应激活化及功能。 方法：不同pH值培养不同时间，模拟椎间盘酸性微环境，建立酸诱导的髓核细胞损伤模型。CCK-8检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。Western blot检测衰老、自噬、凋亡蛋白表达情况。内质网应激特异性阻断剂4-PBA用于阻断内质网应激。透射电镜观察内质网结构变化。采用qRT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光法检测内质网应激的表达活化。 结果：急性酸刺激激活内质网应激，并诱导髓核细胞自噬、老化和凋亡。轻微酸刺激(pH7.0)时，髓核细胞增殖速度加快，而衰老和凋亡相关指标无明显变化，持续延长的酸刺激能降低NPCs活力和增殖能力，并诱导NPCs衰老、凋亡。在pH7.4时，NPCs中内质网应激相关指标表达较低，轻微酸刺激(pH7.0)即可激活内质网应激和UPR反应，严重酸刺激(pH＜6.5)活化内质网应激中促凋亡通路。4-PBA能够降低酸活化的内质网应激，降低自噬并显著加剧酸诱导的细胞凋亡和G1期停滞(p＜0.05)。 结论：NPCs具有一定的酸抗性。急性酸刺激能够诱导内质网应激，内质网应激在急性酸刺激中主要起抗凋亡和衰老的保护性作用，是髓核细胞酸抗性的重要组成部分，严重酸刺激能够导致内质网应激特异性凋亡。 第三部分 ASIC1a的活化与内质网应激的偶联关系 目的：检测酸刺激下NPCs中ASIC1a的表达和激活，探索ASIC1a的激活与内质网应激的偶联关系。 方法：模拟椎间盘的酸性环境，采用Western blot、免疫荧光检测ASIC1a在正常大鼠椎间盘髓核细胞中的表达情况。构建siRNA干扰ASIC1a的NPCs。采用Fura-2/AM荧光探针检测ASIC1a在酸性环境中的活化，CCK8法、Ki67免疫荧光染色评价ASIC1a活化对NPCs活力和增殖的影响，流式细胞术检测ASIC1a活化对NPCs凋亡的影响，qPCR、Western blot检测内质网应激的表达变化情况。 结果：(1)正常NPCs中少量表达ASIC1a，酸刺激能够诱导ASIC1a表达上调，在一定时间范围内，ASIC1a的表达随酸度增加、刺激时间延长而增加。酸度过大或酸处理时间过长，均会导致ASIC1a表达下降。(2)在pH7.4时，细胞内Ca2+浓度处于一个稳定的较低的基线值，pH6.5的酸性溶液刺激能够活化NPCs表面的ASICla，使细胞膜对Ca2+通透性显著上升，导致Ca2+内流明显增加。在不含Ca2+的培养体系或阻断ASIC1a后均可以降低Ca2+内流。(3)CCK8、Ki67及流式细胞术结果提示酸刺激能够降低NPCs活力和增殖能力，诱导髓核细胞凋亡。阻断ASIC1a能够降低酸诱导的髓核细胞凋亡，4-PBA能够使之反转。(5)4-PBA能够明显降低酸诱导的内质网应激蛋白标志物表达，包括GRP78、CHOP和Caspase12，并降低eIF2α的磷酸化水平和XBPI的剪切修饰。阻断ASIC1a能够降低酸诱导上升的GRP78、CHOP和Caspase12在mRNA和蛋白水平的表达，部分降低eIF2α的磷酸化水平，对XBP1的剪切无明显影响。 结论：酸刺激能够诱导ASIC1a的表达及活化，激活后的ASCI1a能引起细胞膜对Ca2+通透性大幅增加，导致细胞钙超载而损伤。阻断ASIC1a能够显著增加酸刺激下NPCs存活率和增殖活力，部分降低酸诱导的内质网应激活化，对UPR影响较小，提示ASIC1a是良好的治疗靶点。