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研究背景先天免疫是生物体在长期的进化中获得的一种抵御外界病原微生物入侵的天然防御机制,是宿主启动免疫应答的基础。无脊椎动物仅具备先天免疫系统,因而是研究先天免疫应答机制的理想生物。无脊椎动物先天免疫研究在以果蝇和线虫为代表的模式生物中取得了较大的进展,获得了深入的认识。近年来,以对虾为代表的海洋无脊椎动物养殖业发展迅速,但也频繁遭受病害的侵袭。因此,需要深入研究对虾的先天免疫应答机制,为相关产业的病害防控提供理论参考与技术支持。研究的科学问题及意义已知,在需氧生物中,由过氧化物歧化酶和过氧化氢酶等组成的抗氧化酶系统在生物体的先天免疫应答中发挥着重要功能。近期的研究成果表明,过氧化物还原酶(Peroxiredoxin, Prx),作为一类多功能的、广泛分布的硫醇依赖性的抗氧化酶,可能参与先天免疫应答。但是,其在先天免疫应答中的具体功能和发挥作用的分子机制尚不明确。因此,在本论文中我们选择具有重要经济价值的无脊椎动物日本囊对虾作为实验材料,深入研究Prx1亚型在对虾抗白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)先天免疫和1-Cys Prx6亚家族蛋白在对虾抗细菌先天免疫中的功能及其作用机制,以期能够揭示这类抗氧化蛋白在动物先天免疫应答中的功能与分子机理,为深入理解动物体内抗氧化酶系统在免疫应答中的功能和对虾病害防控提供帮助。研究结果1、MJPrx1通过介导NF-κB同源蛋白MjDorsal二聚化,促进MjDorsal与病毒ie1启动子的结合,促进WSSV在对虾体内的复制受WSSV感染后,MjPrx家族成员在日本囊对虾鳃组织中呈现不同的表达变化,其中MjPrx1呈现出最为显著的上调表达。RNA干扰实验表明,干扰Mjprx1基因的表达能够提高WSSV感染对虾的存活率,抑制WSSV在对虾体内的复制；而注射纯化的MjPrx1重组蛋白则能够降低wSSV感染对虾的存活率,促进WSSV在对虾体内的复制,表明在对虾体内MjPrx1发挥促进WSSV复制的功能。免疫细胞化学和染色质共沉淀实验证实,干扰Mjprx1基因的表达能够抑制WSSV感染引起的核因子κB (Nuclear factor kappaB, NF-κB)同源蛋白MjDorsal的核移位及其与病毒极早期基因ie1启动子的结合活性。免疫共沉淀结果显示：在对虾体内,MjPrx1能够与MjDorsal相互作用,形成二硫键连接的异二聚体形式；而且WSSV感染能够显著促进二者的相互作用。细胞实验表明,MjPrx1蛋白能够与MjDorsal中的Rel同源结构域(Rel homolog domain, RHD)以二硫键连接的方式形成异源二聚体,并介导MjDorsal RHD结构域形成二硫键连接的同源二聚体。点突变和重组蛋白Pulldown实验结果表明MjPrx1的Cys51残基对MjPrx1与MjDorsalRHD结构域的相互作用有重要影响。并且,对虾体内注射不同形式的MjPrx1突变体蛋白的实验表明,Cys51残基突变的MjPrx1突变体蛋白不能再发挥促进WSSV复制的功能,表明此氨基酸在MjPrx1蛋白发挥促进病毒复制的功能中具有重要作用。以上研究结果证实：MjPrx1能够通过与MjDorsal相互作用,介导其二聚化,促进其活化入核,增强其与WSSV极早期基因ie1启动子的结合活性,促进WSSV在日本囊对虾体内的复制。2、1-Cys亚型Prx6通过维持对虾体内氧化还原稳态,调节抗菌肽基因的表达,在对虾抗细菌免疫中发挥作用鳗弧菌感染日本囊对虾后,能够引起对虾不同组织中MjPrx6上调表达和过氧化氢(H2O2)浓度升高。RNA干扰和鳗弧菌感染实验表明：干扰MjPrx6基因的表达引起对虾存活率显著降低、细菌清除能力下降,表明MjPrx6在对虾抗细菌免疫中具有重要作用。进一步研究发现,干扰Mjprx6会引起对虾体内H2O2异常升高,并且能够抑制细菌感染诱导的某些抗菌肽(antimicrobial peptides,AMP)基因的上调表达。向对虾体内注射抗氧化剂NAC能够降低MjPrx6干扰引起的H2O2异常升高,解除对AMP基因上调表达的抑制作用。表明H2O2浓度可能在调节抗菌肽基因表达中发挥重要作用。向对虾体内注射不同浓度的外源H2O2,模拟不同实验中对虾体内H2O2的浓度变化,结果表明：注射较低浓度的H2O2能够促进相应的AMP基因表达,但对Mjprx6基因表达不产生影响；而较高浓度的H2O2则抑制AMP基因的表达,但诱导Mjprx6基因上调表达。这些结果表明H202能够以剂量依赖性的方式双向调节AMP基因表达,并且诱导Mjprx6的上调表达。向Mjprx6干扰组对虾回补具有过氧化物还原酶活性的MjPrx6重组蛋白能够显著降低Mjprx6干扰引起的对虾鳃组织H2O2异常升高,并修复Mjprx6干扰引起的对虾细菌清除能力下降和AMP基因表达降低等异常表型；而注射无活性的MjPrx6C44S突变体则没有相应的效果。RNA干扰和细菌清除实验进一步表明,由MjPrx6所调节的抗菌肽在对虾抗细菌免疫中发挥重要作用。这些结果表明：MjPrx6能够通过发挥过氧化物还原酶活性,防止细菌感染过程中对虾体内H2O2的过量产生,将H2O2浓度维持在促进AMP基因表达的适当水平,促进对虾的抗细菌免疫反应。研究的创新点本论文主要研究了两种Prx亚型在日本囊对虾先天免疫中的功能与分子机理。研究创新点主要包括以下几个方面：(1)证明Prx1能够与NF-κB同源蛋白MjDorsal相互作用,介导其形成二硫键连接的同源二聚体形式,促进其活化入核,增强其与WSSV iel启动子结合从而促进病毒在对虾体内的复制；(2)首次证明H2O2能够以剂量依赖性的方式对无脊椎动物中免疫效应因子抗菌肽基因的表达进行双向调节；(3)首次证明1-Cys Prx6能够以过氧化物还原酶活性依赖的方式参与动物抗细菌先天免疫过程,并且其保守性的Cys44活性位点具有重要作用。