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研究背景:骨骼肌挫伤是运动性骨骼肌损伤的常见形式,并且伴随着多种免疫细胞的浸润。巨噬细胞的M1/M2极化对挫伤骨骼肌修复具有重要作用,而Treg细胞可调节巨噬细胞M1/M2极化,同时促进损伤骨骼肌修复。但Treg细胞在损伤骨骼肌中聚集,从而调控巨噬细胞极化,参与骨骼肌修复再生的具体机制尚未阐明。另有研究表明,PD-1可调节巨噬细胞M1/M2极化;而Treg细胞也表达PD-1,PD-1可促进外周组织中Treg细胞的产生,对维持Treg细胞的正常功能有着重要作用。因此,本研究的目的是探索PD-1在损伤骨骼肌修复再生过程中的作用,阐明PD-1对Treg细胞生成以及巨噬细胞M1/M2极化的调控,这将加深我们对免疫系统与骨骼肌再生关系的认识。研究方法:40只雄性C57BL/6小鼠随机分为损伤后1天、3天、7天、14天以及未损伤组(WT1、WT 3、WT 7、WT 14、WT con,n=8);30只雄性PD-1敲除C57BL/6小鼠随机分为损伤后1天、3天、7天、14天以及未损伤组(P1、P3、P7、P14、Pcon,n=6)。骨骼肌挫伤后1天、3天、7天和14天取小鼠双侧腓肠肌。苏木素-伊红染色观察骨骼肌形态学变化;Masson染色观察骨骼肌纤维化情况;免疫荧光检测总巨噬细胞、M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞以及Treg细胞数量;RT-PCR检测纤维化相关因子、促炎因子、抗炎因子、氧化应激相关因子、肌再生相关因子的表达变化。研究结果:1.PD-1敲除后骨骼肌挫伤修复受损HE染色结果显示,骨骼肌损伤后第1天,WT组和PD-1-/-组均出现大量肌纤维肿胀坏死,炎性细胞浸润。骨骼肌损伤后第3、7天,WT组骨骼肌中出现部分中央核肌纤维（再生肌纤维）,但PD-1-/-组骨骼肌仅见少量再生肌纤维。骨骼肌伤后第14天,WT组中仅有少量再生肌纤维,而在PD-1-/-组中仍有较多再生肌纤维,且PD-1-/-组再生肌纤维直径显著低于WT组（P<0.05）。2.PD-1敲除对挫伤骨骼肌纤维化程度的影响Masson染色结果显示,损伤后14天,WT组与PD-1-/-组骨骼肌纤维化程度都增加,但WT14组与P14组纤维化程度无显著性差异。此外,WT组与PD-1-/-组Col1a1、Col3a1 mRNA水平在损伤后1、3、7、14天都显著高于未损伤组（P<0.05）。但PD-1-/-组与WT组相比仍然没有显著差异（P>0.05）。3.PD-1敲除对挫伤骨骼肌Treg细胞的影响免疫荧光结果显示,在骨骼肌挫伤后1天,WT组与PD-1-/-组Treg细胞数量无明显差距（P>0.05）。在骨骼肌挫伤后3、7天,WT组Treg细胞数量显著多于PD-1-/-组（P<0.05）。在骨骼肌挫伤后14天,WT组Treg细胞数量接近正常水平,而PD-1-/-组Treg细胞数量仍然变化不大,并多于WT组（P<0.05）。此外,在损伤后1、3、7天PD-1-/-组AREG mRNA水平都显著低于WT组（P<0.05）。4.PD-1敲除对挫伤骨骼肌巨噬细胞极化的影响免疫荧光结果显示,骨骼肌挫伤后1、3、7天,PD-1-/-组M1型巨噬细胞数量显著多于WT组,而M2型巨噬细胞数量显著少于WT组（P<0.05）。此外,WT组与PD-1-/-组总巨噬细胞标志物Mac-2 mRNA水平没有显著差异（P>0.05）;损伤后3天、7天PD-1-/-组M1巨噬细胞标志物iNOS、CD86 mRNA水平显著高于WT组（P<0.05）;损伤后3天PD-1-/-组M2巨噬细胞标志物Arg1、CD206、CD163 mRNA水平都显著低于WT组（P<0.05）。5.PD-1敲除可提高挫伤骨骼肌炎症水平损伤后1、7、14天PD-1-/-组促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平都显著高于WT组（P<0.05）;而在损伤后1天和7天PD-1-/-组抗炎因子IL-4、IL-10mRNA水平显著低于WT组（P<0.05）,TGF-β无显著差异（P>0.05）。6.PD-1敲除可提高挫伤骨骼肌氧化应激水平在损伤后1、3、7天PD-1-/-组氧化应激因子Nox2 mRNA水平显著高于WT组（P<0.05）;而损伤后3天和7天PD-1-/-组抗氧化应激因子Prdx1、Sod1、Gpx4mRNA水平显著低于WT组（P<0.05）。7.PD-1敲除可降低挫伤骨骼肌肌再生水平在损伤后1、3、7、14天PD-1-/-组肌再生因子Pax7、MGF、IGF-1 mRNA水平都显著低于WT组（P<0.05）。研究结论:PD-1敲除减少了挫伤骨骼肌Treg细胞数量,使IL-4、IL-10表达降低,巨噬细胞M1型向M2型转化受阻,表现为肌再生因子下调、炎症反应期延长和氧化应激加剧,损害了挫伤骨骼肌再生。这些结果表明,PD-1可影响Treg细胞生成和巨噬细胞极化促进挫伤骨骼肌修复再生。