帕金森病是一种以中脑黑质部位多巴胺能神经元进行性死亡为丢失为病理特征的神经性退行性疾病，多巴胺能神经元的丢失引起纹状体多巴胺含量的下降，导致了PD患者的一系列临床表现。目前针对PD的治疗临床上仍以药物治疗为主，但目前尚未有一种药物能够安全、高效、长期地对PD进行治疗。因此，寻找一种毒性低，并且能够阻止多巴胺能神经元凋亡，同时能够提升PD患者纹状体地多巴胺含量的药物将具有重要意义。茅莓是一种蔷薇科悬钩子属植物，是一种传统的民间草药，来源十分丰富。以往我室研究显示茅莓粗提物能升高MPTP小鼠模型纹状体多巴胺的含量，并由茅莓抽提物中筛选纯化出两种有效单体，分别鉴定为甜叶甙R1和消旋儿茶素。 本论文采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶或1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导的PD小鼠模型以及PD细胞学模型，研究这两个单体抗PD的作用，研究对JNK和GSK-3β信号通路的影响，并初步探讨了儿茶素抗PD的作用机制。 1.甜叶甙R1对黑质多巴胺能神经元的体内和体外保护作用研究 用MPTP诱导的PD小鼠模型以及MPP+诱导的大鼠中脑腹侧多巴胺能神经元凋亡模型，研究甜叶甙R1抗PD的作用，并检测对MPTP激活的c-Jun和GSK-3β的影响。 实验方法：采用MPP+处理体外原代培养的黑质神经元，用酪氨酸羟化酶免疫荧光化学检测识别多巴胺能神经元。通过计数免疫荧光标记的细胞数目，显示甜叶甙R1对DA能神经元的保护作用。 实验结果： 1.在原代培养的大鼠中脑黑质神经元，10μMMPP+处理后使TH阳性细胞存活数目比正常对照组减少了47.95％，不同浓度的甜叶甙R1加MPP+处理后，甜叶甙R1组TH阳性细胞存活数比MPP+组分别提升了。 2.PD模型小鼠中，MPTP组中脑腹侧黑质组织切片TH免疫组化标记的DA能神经元比正常对照组减少,提示甜叶甙R1有多巴胺能神经元保护作用。 3.用HPLC侧定上述实验组小鼠纹状体DA含量，提示甜叶甙R1可能存在增加纹状体DA释放的作用。 4.MPTP组小鼠的爬竿实验所用时间比常对照组长，悬挂实验和游泳实验评分都比正常对照组降低，具有统计学意义，提示MPTP组小鼠肢体运动协调功能障碍。甜叶甙R1预处理后，行为学检测显示小鼠爬竿实验时间比MPTP组缩短，悬挂实验和游泳实验都比MPTP模型组的评分增加，具有统计学意义提示甜叶甙R1预处理能够改善PD小鼠的行为学表现。 5.小鼠中脑切片免疫荧光结果显示，提示甜叶甙R1可以抑制JNK和GSK-3β激酶。 小结： 1.在原代培养的大鼠中脑DA能神经元等细胞学模型中，实验结果显示MPP+能明显引起这些细胞的死亡，甜叶甙R1可拮抗MPP+的细胞毒性。显示甜叶甙R1具有神经元保护作用。 2.MPTP能够引起小鼠DA能神经元的丢失，纹状体内DA含量下降，小鼠肢体运动协调功能障碍，甜叶甙R1可减少MPTP所致的多巴胺能神经元的丢失，增加MPTP处理小鼠纹状体内的DA含量，改善MPTP处理的小鼠肢体运动协调功能障碍。 3.甜叶甙R1可拮抗MPTP对JNK和GSK-3β的激活，提示甜叶甙R1神经元保护作用可能与此有关。 2.甜叶甙R1对正常小鼠纹状体多巴胺含量以及多巴胺代谢的影响 2.1甜叶甙R1对正常小鼠纹状体DA含量及DA更新率的研究 本实验研究甜叶甙R1对正常小鼠纹状体DA含量及DA更新率的影响。 实验方法：仿照实验1的分组及处理方法； 实验结果：说明甜叶甙R1可以增加正常小鼠纹状体的DA含量；通过(HVA+DOPAC)/DA的比值来比较各组DA更新率，发现甜叶甙R1提升DA含量的同时，各组间更新率无区别。提示甜叶甙R1有促进纹状体释放DA的作用。 2.2甜叶甙R1对正常小鼠中脑腹侧神经组织TH蛋白量的影响 本实验研究甜叶甙R1对正常小鼠中脑腹侧神经组织TH蛋白量的影响。 实验方法：甜叶甙R1以0.5mg/kg剂量分别给予正常小鼠口服灌胃,取小鼠中脑腹侧组织，用Westernblot的方法检测TH蛋白量变化。 实验结果：甜叶甙R1处理1，3，5，6和7天后，TH蛋白量水平比对照组分别增加。 小结： 1.甜叶甙R1可以增加正常小鼠纹状体DA含量。甜叶甙R1处理小鼠的纹状体DA更新率与对照组没有区别。提示甜叶甙R1促进DA合成，加强了纹状体DA能神经元的功能。 2.甜叶甙R1可以增加正常小鼠中脑神经组织的TH蛋白含量。提示甜叶甙R1增高正常小鼠DA含量可能和增加TH蛋白含量有关。 3.儿茶素在帕金森病模型中对多巴胺胺能神经元的体内和体外的保护作用及机制研究 采用MPP+诱导的SH-SY5Y细胞死亡模型、MPP+诱导原代培养大鼠中脑腹侧多巴胺能神经元死亡模型和MPTP诱导的PD小鼠模型来研究(±)-catechin的作用，并研究(±)-catechin对MPTP激活c-Jun和GSK-3β作用的影响。 实验方法：以测定相对乳酸脱氢酶释放量为细胞死亡指标，研究(±)-catechin在MPP+诱导的SH-SY5Y细胞死亡模型中的保护作用。 采用MPP+处理体外原代培养的黑质神经元，用酪氨酸羟化酶免疫荧光细胞化学检测识别多巴胺能神经元。通过计数免疫荧光标记的细胞数目，显示(±)-catechin对多巴胺能神经元的保护作用。 实验结果： 1.在SH-SY5Y细胞中，以对照组LDH释放量作为100％比较，5mMMPP+作用24h后使细胞LDH释放量比对照组增加了87.2％，提示其对MPP+所致的细胞毒性有保护作用。 2.用荧光显微镜显示5mMMPP+处理24h后明显增加了SH-SY5Y细胞内的活性氧水平，提示(±)-catechin具有抗氧化应激作用。 3.Westernblot实验结果显示5mMMPP+处理SH-SY5Y细胞1h后，磷酸化46KD和54KDJNK表达水平比正常对照组分别升高了87.77％和61.53％。 4.在原代培养的大鼠中脑黑质神经元，10μMMPP+处理后使TH阳性细胞存活数目比正常对照组减少了65.9％，3、30和100μM(±)-catechin加MPP+处理后，不同浓度的(±)-catechin组TH阳性细胞存活数比MPP+组分别提升了。 5.PD模型小鼠中，MPTP组TH免疫组化标记的DA能神经元比正常对照组减少44.46％，0.3、3和6mg/kg剂量的(±)-catechin灌胃预处理的TH阳性细胞数目比MPTP组分别增加了。 6.在上述PD模型小鼠中，MPTP组小鼠纹状体内DA含量由正常对照组的0.67±0.03ng/mg降低到0.23±0.01ng/mg，下降了65.09％。0.3、3和6mg/kg剂量的(±)-catechin灌胃预处理后，分别提升小鼠纹状体DA含量至0.29±0.02，0.33±0.02，0.41±0.05ng/mg，比MPTP组DA含量分别升高了26.09％，43.48％和78.26％。 7.MPTP组小鼠的爬竿实验所用时间比常对照组长，悬挂实验和游泳实验评分都比正常对照组降低，具有统计学意义，提示MPTP组小鼠肢体运动协调功能障碍。0.3、3和6mg/kg剂量的(±)-catechin预处理后，行为学检测显示小鼠爬竿实验时间比MPTP组缩短，悬挂实验和游泳实验都比MPTP模型组的评分增加，具有统计学意义，提示甜叶甙R1预处理能够改善PD小鼠的行为学表现。 8.小鼠中脑切片免疫双荧光法检测结果显示，30mg/kgMPTP注射3天6小时后，TH阳性细胞的磷酸化c-Jun(Ser73)水平增高，磷酸化GSK-3p水平降低，提示MPTP增加了c-Jun和GSK-3β活性。而MPTP注射前以6mg/kg(±)-catechin腹腔注射预处理后，能够降低磷酸化c-Jun水平和升高磷酸化GSK-3β(Ser9)水平，说明(±)-catechin可以抑制JNK和GSK-3β通路。 小结： 1.在SH-SY5Y细胞及原代培养的大鼠中脑DA能神经元等细胞学模型中，显示MPP+能明显引起这些细胞的死亡，不同浓度的(±)-catechin可拮抗MPP+的细胞毒性。显示(±)-catechin具有神经元保护作用并呈量效关系。 2.在SH-SY5Y细胞模型中，MPP+可诱导生成大量活性氧，不同浓度的(±)-catechin可抑制MPP+诱导生成的活性氧。显示(±)-catechin具有抗氧化应激能力。(±)-catechin可抑制由MPP+激活的JNK信号通路。 3MPTP能够引起小鼠DA能神经元的丢失，纹状体内DA含量下降，小鼠肢体运动协调功能障碍，(±)-catechin可减少多巴胺能神经元的丢失，增加纹状体内的DA含量，改善小鼠肢体运动协调功能障碍。 4.JNK、GSK-3β的激活参与了MPTP对黑质多巴胺能神经元死亡，而(±)-catechin很可能通过抑制这两条通路的激活保护多巴胺能神经元。 结论： 实验结果显示，甜叶甙R1和(±)-catechin都能够有效地保护多巴胺能神经元，提升小鼠纹状体的DA浓度，改善PD小鼠的行为学表现。这两个单体成份都保护性干预了与神经元凋亡相关的JNK和GSK-3β通路。