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伤寒（typhiod fever）又称为肠热病（enteric fever），是一种古老的由伤寒沙门菌（Salmonella typhi，S.typhi）引起的急性肠道传染病。20世纪80年代末至90年代初，我国十三省市曾发生大规模多重耐药伤寒沙门菌的暴发流行。对591例伤寒沙门菌临床分离株进行药敏、质粒电泳、接合转移、转化及消除试验后发现，流行期间分离的多重耐药菌株均含一分子量98.6×106道尔顿（98.6Md，约159Kb）的耐药质粒，可编码对多种药物的抗性，属不相容性C群（IncC），称之为pRST98。该质粒具有多效性，除编码抗药性外还能增强宿主菌的毒力，是一种既能介导细菌耐药性又能增强细菌毒力的具有双重功能的“嵌合型”质粒。伤寒沙门菌是兼性胞内致病菌，具有靶向感染专职抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）的特点，侵入机体后可定居在树突状细胞（dendritic cell，DC）内生长繁殖。DC是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁，在抗沙门菌感染免疫反应中起着关键作用，任何对DC功能的干扰都可能影响感染结局。本研究通过建立沙门菌感染的细胞模型和实验动物模型，研究伤寒沙门菌质粒pRST98对DC成熟及其自噬过程和免疫功能的影响，揭示其增强宿主菌毒力的发生机理，为下一步继续深入研究质粒的毒力机制提供实验和理论依据。第一部分伤寒沙门菌质粒对DC成熟和自噬过程影响的体外实验以携带pRST98的野生株S.typhi-WT、消除pRST98的伤寒沙门菌突变株S.typhi-Δ-pRST98以及pRST98经接合转移重新导入S.typhi-Δ-pRST98所获得的回补株S.typhi-c-pRST98为研究对象，将细菌与小鼠骨髓来源的DC（bone marrow-derivedDC，BMDC）共培养建立体外感染模型。分别在感染的不同时间段（2h、4h、12h和24h）收获细胞，采用以下方法进行实验检测：①流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测DC表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表达以及DC的吞噬能力；②酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测细胞Th1型细胞因子γ-干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）和白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12）及Th2型细胞因子IL-10的表达；③Western Blot（WB）检测细胞自噬标志蛋白——微管相关蛋白1轻链3-II（Microtubule-associated protein1light chain3-II，MAP1-LC3-II，即LC3-II）和Beclin-1的表达；④透射电镜（transmission electronmicroscope，TEM）观察细胞内自噬小体。实验结果表明，①S.typhi-WT感染组DC表面CD40、CD80和CD86的表达量均显著低于S.typhi-Δ-pRST98感染组（P<0.05，P<0.01，P<0.01）；S.typhi-c-pRST98感染组与S.typhi-Δ-pRST98感染组比较，CD40和CD86的表达量均显著低于S.typhi-Δ-pRST98感染组（P均<0.05）；S.typhi-WT感染组和S.typhi-c-pRST98感染组DC的吞噬率均显著高于S.typhi-Δ-pRST98感染组（P均<0.05）；②S.typhi-WT感染组DC的IFN-γ和IL-12的分泌量均显著低于S.typhi-Δ-pRST98感染组（P均<0.01），而IL-10分泌量显著高于S.typhi-Δ-pRST98感染组（P<0.05），S.typhi-c-pRST98感染后，除了IL-10的分泌量与S.typhi-Δ-pRST98感染组无显著差异外（P>0.05），IFN γ和IL-12分泌量显著低于S.typhi-Δ-pRST98感染组（P<0.01，P<0.05）；③S.typhi-Δ-pRST98感染细胞Beclin-1的表达量显著高于S.typhi-WT和S.typhi-c-pRST98感染组，同时S.typhi-Δ-pRST98感染细胞LC3-II表达增强，而S.typhi-WT和S.typhi-c-pRST98感染组LC3-II仅有微弱表达；④S.typhi-Δ-pRST98感染DC内可见典型的自噬小体。感染后2h和4h有部分细菌被双层或多层膜包裹形成自噬泡，多层膜包裹S.typhi-Δ-pRST98形成的自噬小体于感染后12h与溶酶体融合形成自噬溶酶体，感染后24h观察到内化的细菌被降解。携带嵌合型质粒pRST98的S.typhi-WT感染DC内未观察到自噬小体结构。第二部分伤寒沙门菌质粒对免疫功能影响的体内实验感染的发生和发展过程极其复杂，体内多种因素参与调节并决定感染的结局，建立动物模型能进一步揭示致病菌与宿主相互作用。伤寒沙门菌是一种严格只对人类致病的病原体，没有合适的动物模型和有效的遗传学工具，本研究利用与其有非常近缘关系的鼠伤寒沙门菌（S.typhimurium）的研究途径来研究pRST98质粒毒力基因。S.typhimurium SR-11是携带一分子量为100kb毒力质粒的鼠伤寒沙门菌标准毒株，本研究将SR-11毒力质粒消除后得到的菌株χ3337作为阴性对照，质粒pRST98经接合导入χ3337形成接合子χ3337/pRST98为研究对象，按以下方法进行实验：①如第一部分建立体外感染模型，于感染后2h收集DC，分别进行细胞破膜活菌计数和Annexin V-FITC/PI双染FCM检测，观察不同菌株侵袭DC的能力及对细胞凋亡的影响；②将实验菌株尾静脉感染小鼠，于不同时间段（1d、3d、5d和10d）处死小鼠，收获脾细胞悬液，FCM检测脾脏DC的数量及表面CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表达；脾脏DC胞内细胞因子TNF-α、IL-12和IFN γ的分泌水平；脾脏T淋巴细胞亚群比例及细胞活化指标CD44和CD62L的表达情况；③平板菌落计数法检测感染后肝脏和脾脏内活菌数。实验结果发现：①感染2h，χ3337和χ3337/pRST98感染组DC内细菌数量无显著性差别（P>0.05）；χ3337/pRST98感染组凋亡率显著高于χ3337感染组（P<0.05）；②S.typhimurium感染后小鼠脾脏细胞总数在感染χ3337后3d、5d和10d明显增多（P<0.01，P<0.05，P<0.01）；感染3d开始，DC绝对数量高于control组（P<0.01）；DC绝对数量和百分比在感染5d（P<0.01，P<0.05）和10d（P均<0.05）均高于control组；感染χ3337/pRST98后3d，脾细胞总数显著高于未感染组（P<0.05）；感染5d，细胞总数、DC绝对数量和百分比均显著升高（P均<0.05）；感染10d，脾细胞总数和DC绝对数量仍均显著高于control组（P均<0.05）；χ3337感染组小鼠在感染后5d，CD11c+DC绝对数量以及相对数量都显著高于χ3337/pRST98感染组（P均<0.05）；小鼠感染S.typhimurium后，CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表达量均显著增加；χ3337/pRST98感染组与χ3337感染组比较，CD11c+DC除了CD40的表达量无显著差异（P>0.05），CD80、CD86和MHCⅡ的表达量均显著低于χ3337感染组（P<0.05，P<0.01，P<0.05）；S.typhimurium感染后，小鼠脾脏CD11c+DC的TNF-α、IL-12和IFN γ分泌量显著增加；χ3337/pRST98感染组小鼠脾脏CD11c+DC的IL-12和IFN γ分泌量显著低于χ3337组（P均<0.05），不同菌株感染组间TNF-α的分泌量无显著差异（P>0.05）；③对照组小鼠、感染χ3337小鼠和感染χ3337/pRST98小鼠脾脏中CD3+CD4+Th细胞和CD3+CD8+Tc细胞在淋巴细胞中所占比例这两项指标均无差异（P>0.05）；χ3337和χ3337/pRST98感染后10d淋巴细胞表面CD44表达量显著增高（P均<0.05）；淋巴细胞CD62LlowT细胞群比例显著增加（P均<0.05）；χ3337感染组小鼠在感染后10d，CD44high和CD62LlowT细胞比例都显著高于χ3337/pRST98感染组（P均<0.05）；细菌感染第10d，两组小鼠肝脏和脾脏的活菌数均达到较高水平，χ3337组的肝脏、脾脏活菌数明显低于χ3337/pRST98组（P均<0.05）。结论1．伤寒沙门菌质粒pRST98对宿主菌侵袭DC的能力未见明显改变，但能抑制DC自噬，诱导凋亡，促进细菌在DC内的存活和增殖，从而加重细胞损伤。2．伤寒沙门菌质粒pRST98能影响DC分泌细胞因子的水平，抑制Th1型细胞因子IFN-γ和IL-12，促进Th2型细胞因子IL-10的表达，表明质粒pRST98具有转换不同免疫应答类型的能力，使宿主菌毒力增强实现免疫逃逸。3．携带pRST98质粒的沙门菌毒力株能通过抑制DC成熟，降低细胞提呈抗原的能力，干扰机体内效应性淋巴细胞的活化，导致脏器菌量增加，从而加重机体损伤并最终影响感染免疫的结局。