论文部分内容阅读
目的:明确spata3基因m RNA及其编码蛋白产物在小鼠睾丸组织中的特异表达特性;运用分子克隆技术构建spata3的真核表达质粒并建立spata3过表达HEK293T细胞模型;分析spata3过表达HEK293T细胞中细胞凋亡和细胞自噬相关蛋白的表达;进一步构建spata3过表达慢病毒载体并建立稳定表达GC2-spd细胞模型;分析spata3稳定表达GC2-spd细胞中细胞自噬相关蛋白的表达;为进一步探究在精子发生过程中spata3所发挥的的作用及意义奠定基础。方法:1.采用RT-PCR分析spata3基因m RNA在小鼠各组织中的表达;2.利用Western blotting分析SPATA3蛋白在小鼠各组织中的表达;3.应用免疫组织化学染色检测SPATA3蛋白在小鼠睾丸组织中的细胞定位;4.通过间接免疫荧光染色观察SPATA3蛋白在小鼠生精细胞中的定位分布;5.利用分子克隆技术构建spata3真核表达重组质粒p LV-EGFP(2A)Purospata3;6.采用RT-PCR和Western blotting分析重组质粒p LV-EGFP(2A)Puro-spata3转染HEK293T细胞后spata3 m RNA和蛋白的表达水平;7.采用间接免疫荧光染色检测SPATA3蛋白在过表达HEK293T细胞中的定位分布;8.采用Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白Caspase3、PARP、Bax和Bcl-2以及细胞自噬相关蛋白Lc3A/B的表达水平;9.过表达慢病毒载体瞬时感染HEK293T细胞;采用RT-PCR和Western blotting检测spata3在HEK293T细胞中的瞬时表达;10.建立稳定表达spata3的GC2-spd细胞模型;采用RT-PCR和Western blotting检测spata3在GC2-spd细胞中的稳定表达;11.采用Western blotting检测自噬相关蛋白Lc3A/B在spata3稳定表达GC2-spd细胞中的表达水平。12.采用间接免疫荧光染色检测自噬相关蛋白Lc3A/B在spata3稳定表达GC2-spd细胞中的分布。结果:1.RT-PCR结果显示spata3基因m RNA在小鼠睾丸组织特异表达;2.Western blotting结果显示SPATA3蛋白在小鼠睾丸组织特异表达;3.免疫组织化学染色结果表明SPATA3蛋白主要定位在曲精小管内圆形精子细胞、粗线期精母细胞和长形精子细胞中,间质细胞、支持细胞、精原细胞、前细线期精母细胞中未见SPATA3明显阳性信号;4.免疫荧光分析显示粗线期精母细胞和圆形精子细胞的胞浆与胞核均有显著SPATA3蛋白的阳性着色,长形精子细胞的胞浆也有大量分布;5.DNA测序结果表明重组质粒p LV-EGFP(2A)Puro-spata3构建成功;6.重组质粒转染HEK293T细胞后,经RT-PCR和Western blotting检测表明spata3基因在HEK293T内过表达;7.细胞免疫荧光染色分析显示在HEK293T细胞内过表达的SPATA3蛋白分布广泛,但核周荧光信号明显强于胞核;8.Western blotting结果表明过表达spata3的293T细胞中细胞凋亡相关蛋白及自噬相关蛋白Caspase3、PARP无明显变化,Bax、Lc3A/B蛋白水平高于对照组(P<0.01),而Bcl-2蛋白含量低于对照组(P<0.01),差异具有统计学意义;9.RT-PCR和Western blotting结果表明spata3慢病毒载体在HEK293T细胞中过表达,表明慢病毒载体构建成功;10.RT-PCR和Western blotting结果表明spata3慢病毒载体在GC2-spd细胞中过表达,spata3过表达GC2-spd稳定细胞模型构建成功;11.Western blotting结果表明过表达spata3的GC2-spd稳定细胞中自噬相关蛋白Lc3A/B蛋白含量高于对照组(P<0.01),差异具有统计学意义。12.细胞免疫荧光染色分析显示过表达spata3的GC2-spd稳定细胞中自噬相关蛋白Lc3A/B荧光信号在核周呈点状广泛分布;结论:1.spata3基因在小鼠睾丸组织大量表达,并具有生精细胞定位特异性。2.成功建立了spata3稳定过表达GC2-spd细胞模型。3.spata3基因过表达具有促进HEK293T细胞自噬的作用,而与细胞凋亡没有直接关系。spata3基因过表达能够促进GC2-spd细胞自噬,可能与哺乳类动物精子发生期间的生精细胞自噬密切相关。