研究背景钙化性主动脉瓣疾病(Calcific aortic valve disease,CAVD)是一种常见的心血管疾病,由于缺乏有效的预防和治疗手段而导致发病率和死亡率居高不下,在人口老龄化日益加重的今天,CAVD已成为社会和家庭的经济负担。因此,深入研究CAVD发病过程中的细胞和分子机制非常重要。既往CAVD曾被认为是随机体老化发生的退行性病变。而近年来,对CAVD的进一步研究表明它是一种涉及脂质沉积,炎症反应,磷酸盐信号通路转导的成骨过程。而瓣膜间质细胞的成骨性转变被认为是CAVD发病的主要机制。非编码RNA是一类功能丰富、作用广泛的调节元件,近期多项研究表明,多种micro RNA(mi RNA)参与调控骨形成及瓣膜钙化的过程,但目前对于mi RNAs在钙化性瓣膜疾病中的作用研究仍众说纷纭,更多的mi RNAs在成骨细胞分化通路中的作用及机制尚需要进一步的研究。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)是一类长度超过200 nt的非编码RNA,可以通过与DNA,蛋白及微小RNA相互作用,在表观、转录及转录后等多个层面上参与细胞信号转导及生理活动调控。并且lnc RNA在进化过程中相当保守,而lnc RNA作为mi RNAs竞争性结合因子参与调控基因表达的形式较为常见。尽管目前lnc RNA在钙化性主动脉瓣疾病中的作用尚不明确,但有研究显示mi RNA与lnc RNA相互作用在CAVD的发病和预后中可能起着至关重要的作用。因此,进一步研究mi RNA及mi RNA/lnc RNA调控网络在瓣膜钙化过程中的作用机制,将为探寻CAVD潜在的药物治疗靶点提供依据。研究目的(一)筛选主动脉瓣钙化过程中差异表达的mi RNA并确定目标mi RNA;(二)确定并阐明miR-22在主动脉瓣钙化过程中的作用及具体机制;(三)筛选可能参与调控钙化性主动脉瓣疾病进程的miR-22/lnc RNA调控网络。研究方法(一)临床组织样本及临床资料的采集1.瓣膜组织样本的收集与处理:人主动脉瓣组织取自我院2016年10月至2017年10月接受主动脉瓣置换术的CAVD患者(n=33)和移植受体心脏(n=12)用作非CAVD对照。每个组织样本的一半用作制备瓣膜间质细胞或者立即储存在RNAlater中,另一半迅速固定于4%多聚甲醛或冻存于液氮中以待检测。2.临床资料的采集:采集所收集组织样本患者入院的基本资料、既往史、用药史、血生化和心脏彩超等各项化验检查结果。(二)细胞分离培养鉴定及体外钙化模型诱导1.原代人主动脉瓣瓣膜间质细胞(HAVICs)的分离与培养:术中留取的正常主动脉瓣或钙化瓣膜组织的非钙化部分,用改良的胶原酶消化法消化离心后,重悬于含10%胎牛血清及青霉素链霉素的高糖DMEM中,放置于37℃,CO2浓度为5%的培养箱中,使用稳定传代3代至6代的细胞用于后续实验。2.HAVICs的鉴定:通过免疫荧光法检测间质细胞标志物Vimentin及内皮细胞标志物CD31确定所得细胞纯度。3.体外钙化模型诱导:用含10-7?mol/L胰岛素,50?μg/m L抗坏血酸,2?mmol/L磷酸二氢钠和5%胎牛血清的DMEM完全培养基诱导培养7天构建体外钙化模型。(三)钙化及成骨分化相关检测1.钙化相关检测:茜素红钙染色,硝酸银染色,钙盐测定及碱性磷酸酶活性检测。2.成骨分化检测:实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法分别检测成骨标志物OPN和Runx2的m RNA和蛋白水平的表达变化。(四)差异表达miR-22的功能验证1.miR-22的差异表达:实时荧光定量PCR法分别检测瓣膜组织样本及细胞体外钙化模型中miR-22的表达水平;荧光原位杂交测试检测miR-22的表达定位。2.miR-22的功能验证:将Ad-miR-22,Ad Scramble,shmiR-22和sh Scramble分别转染HAVICs以分别过表达和敲低miR-22,测定转染效率后进行钙化诱导,通过上述实验检测方法验证miR-22对HAVICs成骨转分化的作用。(五)miR-22调控瓣膜间质细胞成骨转分化机制研究1.靶基因确定:利用生物信息学初步预测并筛选miR-22的靶基因,通过双荧光素酶报告基因实验、蛋白免疫印迹法验证两者关系,再进行拯救实验验证靶基因真实性。2.靶基因功能:通过免疫组化、实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测瓣膜组织样本中靶基因的表达水平,之后构建靶基因的过表达及敲低腺病毒,转染HAVICs后成骨诱导,检测靶基因对HAVICs成骨分化的作用。(六)miR-22/lnc RNA调控网络的筛选提取正常及钙化瓣膜组织RNA,通过lnc RNA芯片测定lnc RNA的表达情况并筛选出差异表达的lnc RNA,从中继续筛选与可与miR-22竞争性结合的lnc RNAs以进一步探究miR-22/lnc RNA调控网络在瓣膜钙化中的作用。研究结果(一)瓣膜钙化过程中miR-22的差异表达实时荧光定量PCR(q PCR)检测小样本钙化瓣膜组织中成骨相关mi RNA的表达谱,结果显示,mi R-21,miR-22和mi R-125a/b的表达显著增加,而mi R-10,mi R-214和mi R-204显著降低。q PCR进一步检测33例钙化瓣膜样本中miR-22的表达,证实在钙化主动脉瓣中高表达miR-22。此外,荧光原位杂交结果显示在钙化瓣膜整个区域中均可观察到miR-22,并与波形蛋白共表达,证明miR-22主要定位表达在瓣膜间质细胞中。(二)miR-22在瓣膜间质细胞成骨分化过程中的功能研究过表达和敲低miR-22腺病毒分别转染HAVICs后,茜素红钙染色分析显示,成骨诱导后,miR-22过表达的HAVICs中可观察到显著增加的钙结节,同时,过表达组HAVICs中钙沉积,ALP活性,成骨分化标志物的m RNA和蛋白水平也进一步增加。相比之下,敲低HAVICs中miR-22的表达抵消了成骨诱导的钙结节形成增加,钙沉积,ALP活性,成骨分化标志物的表达。(三)miR-22调控瓣膜间质细胞成骨分化过程中的机制研究利用生物信息学,双荧光素酶报告基因测定和拯救实验确定了CAB39作为HAVIC中miR-22新的下游靶基因。此外,免疫组化,q PCR和WB结果显示CAB39在主动脉瓣钙化过程中表达水平显著降低,且线性分析结果显示CAB39的表达与临床CAVD瓣膜样本的钙化严重程度呈负相关。通过腺病毒介导的在VICs中过表达或沉默CAB39的研究结果表明CAB39在主动脉瓣钙化过程中起保护作用。此外,我们进一步研究了miR-22在CAB39/STRAD/LKB1复合物及其下游AMPK/m TOR信号通路中的作用,结果显示miR-22通过调节CAB39-LKB1-AMPK-m TOR信号传导通路促进HAVIC成骨分化。(四)瓣膜钙化过程中miR-22/lnc RNA调控网络的筛选通过lnc RNA芯片检测正常及钙化主动脉瓣膜组织中差异表达的lnc RNAs,结果显示,共253个差异表达的lnc RNAs由Genespring软件鉴定出,包括70个显著上调和183个下调的lnc RNAs。生物信息学进一步筛选出可能与miR-22相互作用的lnc RNA共40个,但在芯片结果中显著差异表达的只有5个,其中lnc-MLLT1-2和lnc-C5orf42-2显著下调,lnc-STX6-2,NEAT1和SNORA67显著上调。有待进一步探究mi RNA/lnc RNA调控网络在CAVD进程中的作用。研究结论主动脉瓣钙化过程中miR-22表达升高,并通过抑制CAB39/AMPK/m TOR信号通路,成为CAVD的潜在诱导剂,表明miR-22可以作为钙化主动脉瓣疾病的潜在治疗靶标。