背景与目的：　　乳腺癌发病率在全世界女性肿瘤中位居首位，乳腺癌的转移和复发一直是导致乳腺癌患者死亡的主要原因，一旦发生了远处的转移，生存期明显下降。因此，揭示乳腺癌转移的相关信号通路分子，研发新的治疗靶点，是目前乳腺癌研究的热点之一。　　在我们前期研究中，通过外显子测序检测原发灶和转移灶的基因变化，筛选出乳腺转移候选基因Cullin7；后续通过免疫组化染色证实，乳腺癌组织Cullin7蛋白的表达与组织学分级、腋窝淋巴结是否发生转移呈正相关性；表现为在正常乳腺中Cullin7蛋白几乎不表达，而随着乳腺癌恶性程度增加，Cullin7的表达逐步增加，在乳腺癌腋窝淋巴结转移灶组的表达最强。随后，RT-PCR结果同样证实腋窝淋巴结转移灶中的Cullin7mRNA表达水平显著高于乳癌组织和正常组织（P<0.05），癌组织显著高于正常组织（P<0.05）。这些研究结果提示Cullin7可能参与乳腺癌发生、进展和转移。既往研究表明Cullin家族作为泛素化蛋白酶E3骨架Skp-Cullin-F-box（SCF）的重要成员之一，不仅参与细胞间信号传导、细胞周期进程、细胞增殖及凋亡等生理过程，也与肿瘤细胞的形成、进展、转移关系密切。Cullin7作为Cullin家族的一员，被证实参与肺癌、肝癌及黑色素细胞瘤等多种恶性肿瘤的发生和发展，但Cullin7是否参与调节乳腺癌的侵袭、转移，以及相关分子机制尚未阐明。　　众所周知，胰岛素受体底物（Insulin receptor substrates,IRS）是细胞内重要生长信号通路中心枢纽，其上、下游信号分子，如IGF-1、PI3K/Akt、Erk等，不仅在正常情况下参与细胞的生长，代谢，分化和存活，还被证实与肿瘤的发生、发展密切相关。IRS家族主要的成员——IRS-1和IRS-2是机体分布最广的两个蛋白。其中，IRS-1主要在生长信号如胰岛素、IGF-1刺激下，发挥促细胞增殖的作用，而IRS-2则被证实参与乳腺癌、神经间质瘤的侵袭、转移。IRS-1和IRS-2是两个高度同源的蛋白，它们两者之间存在一种相互代偿的机制，如在IRS-1-/-的肿瘤细胞中，IRS-2含量代偿性增加，而且高度磷酸化，但代偿机制尚不明确。在遗传性疾病3M综合症的研究中发现IRS-1是Cullin7的一个底物，Cullin7参与IRS-1蛋白在胞浆中的降解，影响机体生长发育。是否Cullin7参与调控IRS-1/IRS-2比例，进而发挥促进乳腺癌的侵袭、转移的作用，有待进一步证实。　　故本研究拟首先通过Western-Blot技术筛选出高表达Cullin7的乳腺癌细胞株，并利用基因干扰手段降低Cullin7的表达，通过细胞体外侵袭实验、细胞平板克隆实验、免疫荧光实验、Western-Blot、RT-PCR等技术比较Cullin7基因干扰前后细胞侵袭、极性和增殖能力的变化，以及细胞内IRS-1和IRS-2及其下游信号通路PI3K/Akt/GSK3β的表达情况，揭示Cullin7介导IRS-1/IRS-2促进乳腺癌的侵袭、转移的分子机制。　　方法：　　（1）选取8株人乳腺癌细胞株，MCF-7,T47D,BT474,MDA-MB-453,MDA-MB-231,HS578T,BT549,分别测定Cullin7mRNA和蛋白表达，选取高表达Cullin7、侵袭能力强、细胞形态为梭形的乳腺癌细胞株T47D。　　（2）构建Cullin7shRNA慢病毒载体，转染干扰Cullin7，通过嘌呤霉素筛选得到稳定干扰Cullin7表达的细胞株（T47D-shRNA）和阴性对照（T47D-NC）。　　（3）实时荧光定量RT-PCR,Western Blot检测T47D-shRNA和T47D-NC的Cullin7mRNA和蛋白表达水平，Transwell体外侵袭试验检测细胞侵袭能力，平板细胞克隆实验检测细胞克隆的形态变化和增殖方式。　　（4）免疫荧光染色检测Cullin7、IRS-1、IRS-2在T47D-shRNA和T47D-NC的表达差异；Western Blot检测Cullin7、AKT、P-AKT、GSK3β、P-GSK3β蛋白在T47D-siRNA、T47D-NC、T47D间的变化。　　结果：　　（1）在8株乳腺癌细胞株中，Cullin7蛋白表达水平较高的细胞株包括T47D、MDA-MB-231、BT549，这些细胞的形态均为梭形，上皮特异性蛋白E-cadherin表达缺失、符合高侵袭肿瘤细胞的特性。　　（2）在MDA-MB-231细胞株中瞬时转染含不同区域Cullin7-shRNA片段的慢病毒载体，通过实时荧光定量RT-PCR以及western blot检测，发现片段42可使Cullin7mRNA和蛋白的表达减少至阴性对照组的30%以下，这些结果表明片段42的干扰效果最佳。　　（3）将干扰片段42及阴性对照转染到T47D细胞得到稳定转染的T47D-shRNA细胞和T47D-NC细胞；RT-PCR，Western Blot检测证实Cullin7mRNA和蛋白表达均显著减少，分别为阴性对照组的30%和50%(P<0.01)，提示稳定干扰Cullin7的T47D-shRNA细胞株构建成功。　　（4）Transwell体外侵袭试验表明，乳腺癌细胞株T47D-shRNA侵袭能力较T47D-NC，T47D（空白对照组）显著减弱，穿透的细胞数为对照组的30%（P<0.01），此结果表明下调Cullin7导致T47D乳腺癌细胞的迁移能力减弱。　　（5）细胞平板克隆实验发现，与空白对照组及T47D-NC组梭型离散型生长方式不同，T47D-siRNA细胞克隆由梭形向呈柱状聚拢式增殖转变，提示Cullin7表达下调后，细胞极性增强。　　（6）免疫荧光染色结果显示，IRS-1高表达于T47D-shRNA，低表达于T47D-NC；相反，IRS-2低表达于T47D-siRNA，而高表达于T47D-NC。这结果表明Cullin7表达减少，导致IRS-1蛋白降解减少，引起IRS-1表达增多，IRS-2表达减少。　　（7）Western Blot结果显示，与T47D-NC和T47D相比，T47D-shRNA细胞中P-Akt/总Akt(p<0.01)、p-GSK3β/总GSK3β(p<0.05)比值下调，提示AKT活性受抑，而GSK3β活性增加。　　结论：　　（1）Cullin7的表达水平与乳腺癌细胞侵袭转移能力呈正相关性。干扰人乳癌细胞株T47D中Cullin7表达，可以增加细胞间紧密连接，明显降低细胞的侵袭能力。　　（2）人乳腺癌细胞株T47D干扰Cullin7表达后，通过上调IRS-1，代偿性下调IRS-2，抑制下游PI3K/AKT信号通路转导，导致失活状态的p-GSK3β减少，GSK3β活性增加，促使细胞形态由梭形向多边柱状形转化，减弱乳腺癌细胞的侵袭与转移能力。　　综上所述，Cullin7通过促进IRS-1蛋白降解，代偿性增加IRS-2表达，导致PI3K/AKT信号通路过度激活，导致乳腺癌细胞极性丢失，促进乳腺癌细胞侵袭转移。