论文部分内容阅读
猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是圆环病毒科圆环病毒属成员,其病毒粒子无囊膜,基因组是由一条单股、负链、环状的DNA组成。PCV有PCV1和PCV2两个基因型,PCVl对猪是非致病性的,PCV2是引起猪圆环病毒相关疾病的主要病原,给世界养猪业带来了巨大的经济损失。PCV2主要分为五个亚型,即PCV2a、 PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e。本论文主要是对PCV2的亚型鉴定、PCV2的定量检测方法、PCV2a和PCV2b在PK15细胞上的增殖特性、PCV2a和PCV2b在Balb/c小鼠体内的增殖特性进行了研究。本文为PCV2的遗传变异、临床诊断和增殖特性的研究提供了一定的技术支持和理论基础。本论文主要内容如下：试验1.我国部分地区猪圆环病毒2型的亚型鉴定PCV2在我国各省市均有流行,为了了解2011至2012年间江苏、浙江和安徽三省部分猪场PCV2流行毒株的遗传变异情况,本研究利用PCV2检测引物从临床送检样品中筛选出28份阳性病料,利用两对PCV2全长扩增引物对阳性病料进行PCV2全长扩增和测序,然后对它们进行遗传进化分析。结果表明,全长序列为1767bp的有25个,为1768bp的有2个,为1766bp的有1个；28个毒株之间的核苷酸同源性为94.2%-100%,与13个参考毒株的核苷酸同源性为93.9%-100%；有3株为PCV2a,1株为PCV2b,24株为PCV2d,没有PCV2c和PCV2e.这表明当前主要的流行毒株是PCV2d。试验2.两种猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用依据PCV2ORF1和ORF2基因的相对保守序列,分别设计合成两组特异性引物和TaqMan探针,构建分别包含PCV2ORF1和ORF2基因全长的重组质粒作为标准品,经过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,建立了两种检测PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR方法。所建立的两条标准曲线的Ct值与起始模板拷贝数的对数之间具有良好的线性关系,相关系数R2均在0.99以上,扩增效率均在90%-110%之间；重复性好,组内变异系数均小于5%；特异性强；敏感性高,ORF1方法可达1.0×101copies/μL, ORF2方法可达1.0×102copies/μL。分别用两种方法对临床样品进行检测并比较检测结果。结果表明,由于一些临床样品中P1的存在,基于ORF1建立的定量检测方法更为准确、特异性更强,可用于PCV2的快速诊断和定量检测。试验3.猪圆环病毒2型两亚型分离株在PK15细胞上的增殖特性研究为了研究猪圆环病毒2型的两个主要亚型,即PCV2和PCV2b在体外的增殖特性,我们分别将本实验室分离的PCV2和PCV2b毒株接种PK15细胞进行连续传代,对两亚型毒株的体外增殖特性进行了研究。利用荧光定量PCR方法对各代次病毒含量进行定量检测,利用细胞免疫荧光方法对第10代、20代、30代、40代、50代、60代细胞毒进行TCIDso测定,比较两亚型毒株在体外的增殖特性。研究结果表明,随着传代次数的增加,两亚型病毒的感染滴度均有明显的提高,但是PCV2b的增殖速度要明显高于PCV2a的。试验4.猪圆环病毒2型两亚型分离株在Balb/c小鼠体内的增殖特性研究为了研究PCV2a和PCV2b两亚型毒株在Balb/c小鼠体内的增殖特性,本文将两亚型毒株分别接种Balb/c小鼠,利用荧光定量PCR, ELISA等方法对小鼠各脏器中的病毒含量、血清中病毒和抗体水平等指标进行了研究。结果表明,PCV2a和PCV2b两亚型毒株均能在小鼠体内增殖,不同的是,后者的增殖能力要更强一些。本文为深入研究PCV2两亚型的致病机理奠定了一定基础。