论文部分内容阅读
目的通过检测人骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其诱导分化的软骨细胞中miRNA基因的表达谱,筛选出诱导分化前后差异表达的miRNAs,寻找可能的人BMSCs向软骨分化过程中具有调控作用的miRNAs,为进一步阐明miRNA在BMSCs软骨分化过程中的作用和意义提供实验基础。方法(1)利用密度梯度离心法自人骨髓中分离BMSCs,在体外扩增传代培养,通过对其形态特点的观察及细胞表面标志物检测,对培养的人BMSCs进行鉴定。(2)采用体外细胞团三维培养方法,用含有TGF-β1、地塞米松、胰岛素、牛血清白蛋白和维生素C的培养液诱导人BMSCs向软骨细胞方向分化,通过甲苯胺蓝、s-100蛋白免疫组织化学染色对诱导分化的软骨细胞进行鉴定。(3)利用miRNA基因芯片技术,检测人BMSCs及其诱导分化的软骨细胞miRNAs的表达谱,通过SAM软件分析筛选出人BMSCs和其分化的软骨细胞之间表达差异性的miRNAs。(4)采用实时定量PCR方法对筛选出的差异表达的miRNA基因进行验证并预测其潜在的靶基因。结果(1)经骨髓分离培养所得到的细胞,通过流式细胞仪检测的结果为:细胞表面标志物CD29、CD44为阳性,CD34、CD45为阴性,符合骨髓间充质干细胞特征。(2)人BMSCs经TGF-β1、地塞米松、胰岛素、牛血清白蛋白和维生素C诱导21天后,甲苯胺蓝、s-100蛋白免疫组织化学染色均阳性,符合软骨细胞的特征。(3)用miRNA基因芯片检测了两组样品中人BMSCs及其诱导分化的软骨细胞miRNAs的表达谱,并筛选出了在该两种细胞中表达的差异性的miRNAs。在两组样品中,软骨细胞较BMSCs高表达的miRNAs分别为:26个、7个(两组共同存在的为5个);软骨细胞较BMSCs低表达的miRNAs在两组样品中分别为:1个、2个(两组共同存在的为0个)。(4)针对筛选出的4个在软骨中高表达的miRNAs利用实时定量PCR的方法在第3组样品中进行验证,结果均与芯片检测的结果一致。结论(1)用密度梯度离心法可以从骨髓中分离得到人BMSCs,并可在体外培养将其诱导分化为软骨细胞。(2)来自不同个体的人BMSCs及其诱导分化的软骨细胞之间miRNAs的表达存在很大差异性(3)在人BMSCs和其诱导分化的软骨细胞之间存在表达差异的miRNAs,这些差异性的miRNAs可能对人BMSCs的软骨诱导分化起着一定的调控作用。