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研究背景及目的食管癌是一种高度侵袭性恶性肿瘤,在所有恶性肿瘤中发病率排名世界第八位,死亡率排名世界第六位。食管癌有两种常见病理类型,食管鳞状细胞癌和食管腺癌。中国是世界上食管癌发病率最高的国家,且病理类型以鳞癌为主。由于食管癌早期无明显症状,确诊时多数患者已发生淋巴结浸润转移因而失去了手术机会。尽管在过去十年,食管癌患者的术后生存率得到了一定程度的改善,但由于食管癌侵袭转移的发生率较高,因此患者的总体生存率仍然不够理想。转移是恶性肿瘤的重要生物学特性,被认为是导致患者病情恶化的最关键因素。有研究显示在未发生转移的食管癌中,患者5年生存率为40%;但是在已经发生转移的食管癌中,患者5年生存率仅为4%。因此,对食管癌侵袭转移的机制进行探索,深入了解食管癌侵袭转移的关键分子及其与预后的关系,为食管癌治疗提供新的治疗靶点是目前研究的主要方向。X-连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)参与细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移、免疫、炎症等多种细胞生物学过程。XIAP是由三个BIR结构域、一个UBA结构域和一个RING结构域组成的含有497个氨基酸的蛋白质,其基因位于X染色体的Xq25区域。XIAP在不同类型的恶性肿瘤中均有高表达,且其高表达可能与化疗耐受、疾病进展及不良预后相关。最新研究发现XIAP在肿瘤侵袭转移中发挥重要作用。有学者发现XIAP可以通过其下游效应因子RhoGDIβ,在膀胱癌中促进肿瘤侵袭转移;也有学者认为XIAP可以通过抑制C-RAF/MAPK信号通路,在宫颈癌中抑制肿瘤侵袭转移。以上研究结果表明XIAP在不同类型肿瘤中,对肿瘤侵袭转移的影响具有显著差异。在食管癌中,XIAP对肿瘤侵袭转移的影响及具体作用机制尚未明确。为了研究食管鳞癌侵袭转移的具体作用机制,首先我们拟采用免疫组化方法对食管鳞癌临床组织标本进行检测,明确XIAP与食管鳞癌临床病理关系以及对患者预后的影响;然后在体外实验通过干扰XIAP表达探索XIAP对食管鳞癌细胞侵袭迁移和上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的影响;接着在裸鼠体内实验研究XIAP对食管鳞癌肺转移的影响;随后在体外实验明确XIAP影响食管鳞癌侵袭转移的具体作用机制;最后在临床组织标本中验证XIAP与下游信号通路蛋白表达的相关性。本课题主要分为以下三个部分:第一部分:XIAP在食管鳞癌中表达和临床病理资料的相关性研究目的:研究食管鳞癌中XIAP表达与临床病理指标和预后的相关性方法:收集185例食管鳞癌临床组织标本及病理学资料,采用免疫组织化学染色方法检测185例食管鳞癌组织标本XIAP的表达水平,分析XIAP表达与临床指标的相关性。结合患者随访资料利用Kaplan-Meier生存曲线分析XIAP表达对食管鳞癌患者总体生存率的影响,利用Cox回归方法分析XIAP与食管鳞癌患者预后的相关性。结果:食管鳞癌中XIAP高表达与其淋巴结转移具有明显相关性(P=0.018)。XIAP高表达与患者年龄,性别,肿瘤分化程度,肿瘤大小,TNM分期等无明显相关性(P>0.05)。通过对185例患者进行随访,我们发现XIAP高表达患者的总体生存率明显低于XIAP低表达患者(P=0.004)。Cox回归分析表明XIAP高表达是影响食管鳞癌患者预后的独立危险因素(P=0.028)。结论:食管鳞癌中XIAP高表达与其淋巴结转移密切相关,XIAP高表达是影响食管鳞癌患者预后的独立危险因素。第二部分:XIAP对食管鳞癌细胞EMT及侵袭转移的影响目的:探究XIAP对食管鳞癌细胞EMT及侵袭转移的作用方法:1.使用慢病毒介导的sh-XIAP转染食管鳞癌细胞系EC9706和TE13,建立干扰组;同时使用sh-Ctrl转染食管鳞癌细胞系EC9706和TE13,建立对照组。采用Real-time PCR和Western-blot方法检测干扰组和对照组XIAP mRNA和蛋白表达,确保干扰有效。2.体外实验中,对sh-XIAP和sh-Ctrl组EC9706和TE13细胞系进行划痕实验和Transwell实验,检测两组细胞侵袭迁移能力的变化。采用Real-time PCR方法检测sh-XIAP和sh-Ctrl组EMT相关蛋白E-cadherin,N-cadherin和Vimentin的mRNA表达水平,同时采用Western-blot和细胞免疫荧光方法检测sh-XIAP和sh-Ctrl组EMT相关蛋白E-cadherin,N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平和免疫荧光强度。3.体内实验中,采用食管鳞癌细胞裸鼠尾静脉注射的方法,建立裸鼠食管鳞癌肺转移模型。实验组注射sh-XIAP转染的EC9706细胞系,对照组注射sh-Ctrl转染的EC9706细胞系,两个月后处死裸鼠,观察XIAP对食管鳞癌肺转移的影响。结果:1.成功建立XIAP干扰食管鳞癌细胞系TE13和EC9706,结果显示XIAP干扰组和对照组病毒转染效率均超过90%,且干扰组XIAP mRNA和蛋白水平表达均显著低于对照组。2.体外实验发现XIAP干扰后食管鳞癌细胞系侵袭迁移能力明显下降,并且EMT相关标志物变化明显,结果显示上皮标志物E-cadherin显著升高,而间充质标志物N-cadherin和Vimentin显著降低,体外实验结果表明XIAP可诱导食管鳞癌细胞发生EMT样改变。3.通过裸鼠食管鳞癌肺转移模型的建立,发现XIAP干扰后在裸鼠体内没有发生肺转移而对照组裸鼠肺转移明显,提示XIAP具有明显促进食管鳞癌肺转移的作用。结论:在食管鳞癌细胞系中干扰XIAP后,上皮标志物E-cadherin显著升高,而间充质标志物N-cadherin、Vimentin显著降低。同时XIAP可以明显促进食管鳞癌发生肺转移。以上研究结果表明XIAP可诱导食管鳞癌细胞获得EMT表型并促进肿瘤侵袭转移。第三部分:XIAP促进食管鳞癌细胞EMT及侵袭转移的作用机制研究目的:探索XIAP促进食管鳞癌细胞EMT及侵袭转移的作用机制方法:1.首先采用Real-time PCR和Western-blot方法检测sh-XIAP和sh-Ctrl组TGF-β的表达。然后在食管鳞癌细胞中加入TGF-β抑制剂作为实验组,对照组为未处理的食管鳞癌细胞,Real-time PCR和Western-blot分别检测两组细胞XIAP的mRNA和蛋白表达水平。2.建立sh-XIAP+TGF-β实验组,Transwell实验检测sh-Ctrl,sh-XIAP,sh-XIAP+TGF-β三组细胞的侵袭迁移能力。Real-time PCR和Western-blot分别检测三组细胞EMT相关蛋白(E-cadherin,N-cadherin和Vimentin)的mRNA和蛋白表达水平。3.采用免疫组化方法检测食管鳞癌临床组织标本中XIAP和TGF-β的表达,分析XIAP和TGF-β表达的相关性。结果:1.通过对干扰XIAP后食管鳞癌细胞TGF-β的检测,我们发现下调XIAP后TGF-β表达明显降低。当抑制TGF-β表达时,XIAP在mRNA和蛋白水平均未发生明显变化。2.Transwell实验结果提示sh-XIAP+TGF-β组穿膜细胞数明显高于sh-XIAP组。Real-time PCR和Western-blot结果提示sh-XIAP+TGF-β组与sh-XIAP组相比,上皮标志物E-Cadherin表达降低,间充质标志物N-Cadherin和Vimentin表达升高,两组差异具有统计学意义。3.食管鳞癌临床组织标本中XIAP和TGF-β表达具有正相关关系(r=0.3241,P<0.001)。结论:XIAP可以通过TGF-β信号转导通路诱导食管鳞癌细胞发生EMT并促进肿瘤侵袭转移。全文结论食管鳞癌临床组织标本中XIAP高表达与其淋巴结转移密切相关,也是影响食管鳞癌患者预后的独立危险因素。体内外实验显示XIAP可以明显促进食管鳞癌发生肺转移,其机制可能是通过TGF-β信号转导通路诱导食管鳞癌细胞发生EMT,从而促进食管鳞癌侵袭迁移。食管鳞癌组织标本中XIAP和TGF-β表达呈正相关,再次验证XIAP通过TGF-β信号通路促进食管鳞癌侵袭转移。