第一部分 猫骨髓源性神经干细胞的培养和鉴定 目的 1、观察家猫骨髓基质细胞体外培养情况；2、探索其诱导分化为神经干细胞的可行性，为家猫骨髓基质细胞作为自体神经干细胞种子细胞提供理论依据。 材料和方法 1、材料：经检疫健康合格的成年家猫20只，雌雄各半，年龄1～2岁，体重2.5～4.0kg。 2、方法：氯胺酮肌肉注射麻醉后，从后肢股骨下端内侧抽取骨髓3～5ml，加神经干细胞培养基稀释，然后加入含细胞分离液3～4ml的离心管中，经密度梯度离心后分离得到骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)。分离得到的BMSCs用神经干细胞培养基(Neural Stem cells medium，NSCM)重悬浮为(1～2)×10~5个/ml，种植于24孔培养皿中，给予不同的培养条件进行诱导分化。 根据培养基添加血清及因子情况不同分4组：(1)单纯NSCM组；(2)NSCM+FCS(20％终浓度)组；(3)NSCM+LIF(20ng/ml)+bFGF(20ng/ml)组；(4)NSCM+FCS(20％终浓度)+LIF(20ng/ml)+bFGF(20ng/ml)组。 根据去非贴壁细胞时间不同分4组:(1)4h组，培养4h去除非贴壁细胞;(2)24h组，培养24h去除非贴壁细胞;(3)4sh组，培养4sh去除非贴壁细胞组;(4)不去除贴壁细胞组。 倒置相差显微镜下观察不同培养条件下活细胞及免疫细胞化学染色情况。结果 猫BMSCS在无血清培养中不管是否添加LIF和bFGF都不能正常生长，大部分细胞很快凋亡;在有血清培养中，不管有无LIF和bFGF细胞生长都无明显差别，接种4h去除非贴壁细胞，可发现个别细胞贴壁，贴壁细胞呈椭圆形，有单个小突起，继续培养发现这些细胞无增殖，并且很快消失;培养24h后贴壁细胞数目明显增加，并看到有细胞突起增多增长，继续培养发现大部分细胞数量较多的培养孔细胞可增殖;培养48h后可观察到贴壁细胞有分裂增殖，继续培养l一2周细胞爬满培养皿底部，可传代重复上述过程，如不传代，在贴壁细胞上可长出大圆形细胞，并可形成克隆。在未去除非贴壁细胞的观察中发现:24h内即有大圆形细胞出芽，以后出芽端不断增长，并贴壁生长，这些细胞以后可形成岛屿状细胞克隆团，给予适当的分化条件后这些细胞能分化成具有细长突起、多种形态的细胞。 BMSCS在培养6一7天后，这些具有增殖能力的BMSCS表达神经干细胞特异性抗原Nestin，而且能将其诱导分化出神经元样细胞，免疫细胞化学检测可见有NSE、NeuN抗原表达。结论 家猫BMscS需要在有血清培养基中才能正常生长，其培养需要有一定密度，其具有干细胞特征，可传代扩增，经诱导可表达神经干细胞特异性抗原Nestin，在合适的条件下可分化出NetlN、NSE阳性细胞等具有神经细胞特征的细胞，证实家猫BMSCs可诱导为神经干细胞。第二部分猫骨髓源性神经干细胞移植修复视皮层损伤的实验研究 目的 1、建立猫视皮层损伤偏盲模型;2、探索猫骨髓源神经干细胞(Neuralstem cells，NSCs)修复视皮层损伤的可行性。材料和方法 1、材料:成年健康家猫10只(经术前神经生物学检查无异常)。 2、方法: (l)在全麻下行开颅手术，·电凝烧灼切除右侧枕叶皮层及与视觉有关的颗顶叶皮质(包括5、7、17、18、19、Zoa、20b、Zla、Zlb、DLS、VLS、PS、PMLS、PLLS、AMLS、ALLS和SVA等皮层区域及EVA的一部分)。术后行神经生物学检查，观察视野情况。 (2)从已经建模成功的偏盲动物抽取骨髓(术后5周)，从中分离得到BMSCS，在体外给予神经干细胞培养基培养增殖(1周)，经BrdU标记(3天)后植入视皮层损伤区，观察:a、动物模型行为学改变;b、用免疫组织化学方法观察移植细胞存活情况(移植术后24周灌注取材)。结果 l、制作偏盲模型10例，均为右侧视皮层切除。死亡2例，左侧瞬目反射消失7例、1例反射正常。左侧定向反射消失6例，未消失2例。 2、经干细胞移植治疗的视皮层损伤动物模型在本实验所观察的时限内未见有明显的行为学改变，但免疫组织化学检测发现损伤区有Brdu及Nestin阳性细胞。结论 l、通过切除单侧枕叶及与视觉有关的颖顶叶皮层，可以成功制作偏盲动物模型。 2、猫骨髓源性干细胞在移植入皮层损伤动物模型后，可以在脑内存活并分化为神经元样细胞，因而可以考虑将其作为视觉功能缺失细胞治疗的种子细胞。