目前研究发现,90多个基因影响小鼠皮肤及毛发,其中有数十种能够引起小鼠皮肤和被毛结构的突变。除众所周知的常用于免疫学科、肿瘤学科等研究的裸鼠外,在美国、日本等发达国家还培育繁殖了多达二十多个突变的无毛小鼠的品种,其可为护肤品的研制、皮肤病的研究提供丰富的实验材料,而我国至今培育的该类小鼠较少,应用不广泛。本研究中所用到的动物模型,是由本研究单位自己培育成群的一种自发突变的Uucv无毛突变小鼠。它的遗传表现:纯合突变为无毛表型,杂合突变是稀毛表型。在之前的遗传学相关研究中,发现该小鼠被毛的异常是由单基因的常染色体半显性遗传引起。其后代的表型严格遵循孟德尔遗传规律。裸鼠经过皮肤能够观察到一些内脏器官的形态,但该突变小鼠与裸鼠有差异,该鼠免疫功能正常,皮肤较裸鼠厚。在生物医学方面,由于该突变纯合子小鼠无毛、操作简便易行,能在普通环境下存活、繁殖。基于这些特点,该鼠可用于皮肤学、化妆品等领域的研究。在前期课题组成员的研究中,通过基因连锁分析最终确定,突变基因位于小鼠11号染色体的D11mit338和D11mit337之间,并通过基因组扫描方式定位了该突变基因为i Rhom2(iRhom2^mut)。果蝇的i Rhom2通过与ER配体家族的相互作用,可以调节EGF信号通路,分流到ER相关的降解（ERAD）途径。i Rhoms家族在所有多细胞动物中都是保守的,且在细胞培养中的鉴定也极为相似,i Rhom1和i Rhom2都能促进EGF的降解。与i Rhom1不同的是,i Rhom2在免疫细胞大量表达,尤其是巨噬细胞,且它的表达上调刺激LPS应答。TACE为TNF的转化酶,与野生型i Rhom2细胞相比,突变型的i Rhom2的巨噬细胞无TACE,这意味着细胞内外运输存在根本的缺陷。iRhom2^mut基因的N端有309bp的缺失,缺失区域包括外显子和内含子,其中缺失的内含子完整。而外显子缺失231bp,刚好是一个完整的阅读框,从而导致了无毛性状的产生。虽然i Rhom2蛋白在进化过程中已经失去了蛋白酶活性,但它们仍然保持着重要的非蛋白酶活性,主要是与蛋白水解释放有关。i Rhom2必须要与TACE结合,才能将其从内质网转运到高尔基体。TACE的前体必须要在高尔基体内经过furin的剪切才能成熟,从而影响其下游蛋白的分泌,如熟知的TNF-α、EGF。因此,i Rhom2可以通过控制TACE的表达量影响其下游蛋白的分泌。且i Rhom2可以经过TACE调节Notch1和Wnt信号通路,从而影响毛囊的分化。i Rhom2的另一个功能是能够通过ERAD作用于EGF前体从而降解EGF。课题组前期的工作也证实i Rhom2能够影响TACE基因的成熟,但新的文献报道i Rhom2的基因敲除小鼠,反而具有被毛。这些结果推测,i Rhom2基因的N端309bp的缺失,可能使突变蛋白具有了新的功能。因此课题组拟构建稳定表达野生型i Rhom2以及iRhom2^mut的细胞系,为对iRhom2^mut进行新的功能的相关研究打下基础,以期为研究毛囊的特性提供较好的实验动物模型。本研究初步探讨了野生型i Rhom2和iRhom2^mut在Vero细胞中的表达情况、目的蛋白的定位、以及对Vero细胞生长情况的影响,包括以下方面:（1）野生型i Rhom2及iRhom2^mut基因的获得采用分子克隆技术,剪取Uncv无毛小鼠的鼠尾并提取基因组,设计引物鉴定突变基因为阳性。其后提取阳性小鼠皮肤RNA,经反转录得到c DNA后,根据NCBI公布的i Rhom2序列设计引物,PCR扩增获得野生型i Rhom2及iRhom2^mut的基因编码区,经琼脂糖凝胶电泳鉴定后,胶回收PCR产物,连接T载体摇菌后涂板,对重组质粒进行测序,正确后4℃冰箱储存备用。（2）野生型i Rhom2及其突变基因iRhom2^mut稳定表达细胞系的建立应用基因重组技术,将获得的野生型i Rhom2和iRhom2^mut基因片段克隆到慢病毒载体Lenti-OE-Flag,构建重组慢病毒载体Lenti-OE-i Rhom2和Lenti-OE-i Rhom2 mut,并通过PCR、双酶切、测序等方法进行重组质粒的鉴定,构建成功的重组质粒用于后续实验。同时,通过利用293T包装细胞,对重组质粒Lenti-OE-i Rhom2和Lenti-OE-i Rhom2 mut进行病毒包装,收集的病毒颗粒感染目的细胞,进行滴度测定,进而通过puromycin抗生素进行筛选,建立野生型i Rhom2及iRhom2^mut的Vero细胞稳定表达株。经过Western Blot验证,蛋白为95KD,与预期蛋白质分子量吻合,成功获得稳定细胞系。（3）PKH26和Hoechst33258联合示踪目的蛋白目的蛋白和绿色荧光蛋白融合表达后,可以在荧光显微镜下直接观察到目的蛋白的位置。PKH26和Hoechst33258两种荧光染料均可良好地标记细胞,但将PKH26膜染料和Hoechst33258核染料两者联合起来进行标记的文献鲜有。本研究采用PKH26和Hoechst33258联合标记野生型i Rhom2及iRhom2^mut的稳定细胞系,显示双标方法成功。通过激光共聚焦荧光显微镜观察目的蛋白,发现野生型i Rhom2分布在细胞的胞浆,而iRhom2^mut于细胞浆内和细胞核内都存在,推测i Rhom2的N末端缺失突变可能对其细胞内的定位有影响。（4）野生型i Rhom2及iRhom2^mut对细胞生长特性的影响本课题分别通过WST-1法和Annexin-V/PI法检测细胞增殖能力和细胞凋亡的情况,并与正常的导入空载体的Vero细胞相比较。流式细胞术结果发现,过表达的野生型i Rhom2和iRhom2^mut均可以抑制Vero细胞的凋亡。同时,对WST-1检测的结果做出生长曲线,发现野生型i Rhom2和iRhom2^mut可以提高细胞活力。提示野生型i Rhom2和iRhom2^mut可能促进细胞生长因子的表达和分泌,进而使凋亡率降低。结论:野生型i Rhom2和iRhom2^mut可以增强细胞活力;野生型i Rhom2分布在细胞的胞浆,而iRhom2^mut细胞浆内和细胞核内都存在;i Rhom2的N末端缺失影响其亚细胞定位。综上所述,该小鼠模型的研究能够为研究人类毛发疾病提供动物模型的基本理论,也为今后使用药物或基因治疗方法治疗脱发等相关研究提供了良好的实验材料。