单核非血红素铁氧化酶是自然界中非常重要的一大类氧化酶,它们以催化的化学反应种类多样而著称,包括脱氢反应、羟化反应、环氧化反应等。在天然产物的生物合成中,单核非血红素铁氧化酶扮演了非常重要的角色,本论文的主要研究对象OvoA蛋白和PtlH蛋白都属于这一大家族。Ovothiol是组氨酸硫醇衍生物,它除了作为抗氧化剂,还具有抗肿瘤的活性。在Ovothiol的生物合成过程中,非血红素铁氧化酶OvoA负责其中最核心的步骤,即将组氨酸和半胱氨酸偶联形成碳硫键。戊丙酯菌素是链霉菌产生的一种抗菌活性很好的萜类衍生物,在它的生物合成途径中有六步后修饰反应,其中一步是由非血红素铁氧化酶PtlH催化的羟化反应。OvoA酶以组氨酸和半胱氨酸为底物催化生成两种产物:其一是组氨酸和半胱氨酸偶联形成亚砜产物,其二是半胱氨酸氧化生成半胱氨酸亚硫酸。野生型OvoA蛋白催化的反应,亚砜产物和半胱氨酸亚硫酸产物的比例约为9:1。将OvoA蛋白第417位酪氨酸用苯丙氨酸替代,OvoA Y417F突变体蛋白催化的反应产物绝大部分为半胱氨酸亚硫酸。进一步用非天然氨基酸(硫甲基酪氨酸,MtTyr)替代OvoA Y417,OvoA Y417MtTyr突变体蛋白催化产生的亚砜产物和半胱氨酸亚硫酸产物的比例约为7:3。以上结果表明OvoA Y417对亚砜产物的生成起决定性的作用,通过定点突变改变此氨基酸可以调节两种产物的产生比例。为了阐明OvoA酶学反应机理,本研究使用了“同位素敏感分枝”的方法研究OvoA酶学反应中的两种产物是如何分配的。使用高分辨质谱和13C核磁共振两种检测方法,我们计算得出野生型OvoA蛋白反应的底物同位素效应为1.01 ±0.02,溶剂同位素效应为1.29±0.01。含有非天然氨基酸的OvoAY417MtTyr突变体蛋白反应的底物同位素效应为1.08± 0.01,溶剂同位素效应为2.09 ± 0.02。以上同位素效应测定结果表明亚砜产物和半胱氨酸亚硫酸产物来源于同一个酶促反应中间体,本研究认为该中间体含有铁(Ⅲ)-超氧化物自由基。如果三价铁从底物半胱氨酸的硫原子上获得电子还原成二价铁,形成基于半胱氨酸的自由基,则反应朝着生成半胱氨酸亚硫酸的方向进行。如果从OvoA Y417上发生一个质子并电子的转移到铁(Ⅲ)-超氧化物自由基,形成铁(Ⅲ)-过氧化氢和基于酪氨酸的自由基,则反应朝着生成亚砜产物的方向进行。PtlH是非血红素铁单加氧酶,催化倍半萜骨架1-deoxypentalenicacid的羟化反应。已发表的PtlH蛋白晶体结构显示,PtlH中的第142位酪氨酸(Y142)位于铁核心和底物之间,在底物结合之前Y142有开放和关闭两种构象,底物结合以后则只有关闭一种构象。本研究对PtlHY142进行定点突变,使用苯丙氨酸替代酪氨酸以后,PtlH Y142F突变体蛋白与野生型PtlH蛋白相比活性没有明显变化;使用丙氨酸替代酪氨酸以后,PtlH Y142A突变体蛋白几乎没有活性。本研究还发现PtlH催化的反应,除了生成正常的羟化产物11β-hydroxy-1-deoxypentalenicacid以外,还有可以生成两次羟化的副产物。在PtlH反应体系中添加抗坏血酸(维生素C)以后,反应的kcat提高七倍,并且副产物的产生明显变少,本研究称其为抗坏血酸效应。分子对接模拟给出了 PtlH中抗坏血酸的可能结合位点,用色氨酸代替结合位点中的113的丝氨酸后,PtlH S113W突变体蛋白不再表现出抗坏血酸效应。以上结果表明,PtlH Y142的羟基对反应活性影响不大,但是酪氨酸的苯环与底物之间可以发生疏水相互作用,影响底物的结合和产物的释放。与以往的认识不同,抗坏血酸不仅仅只作为还原剂提高PtlH反应的速率,它还直接影响了PtlH反应的产物生成。抗坏血酸可能通过提高产物的释放效率,避免了正常羟化产物被再次羟化形成副产物。本研究发现了 PtlH的抗坏血酸效应并首次确定了抗坏血酸的结合位点,这表明抗坏血酸除了作为还原剂还是一种蛋白构效因子,它丰富了我们对氧化还原反应中抗坏血酸功能的认识。