论文部分内容阅读
目的:程序性细胞死亡在椎间盘退变中发挥重要作用,但自噬及自噬性细胞死亡在椎间盘退变中的发生机制及具体作用尚不明确。本研究通过构建鼠纤维环细胞体外培养体系,探讨压力对鼠纤维环细胞自噬与线粒体损伤应激的影响,分析自噬及自噬性细胞死亡在椎间盘退变中的可能发生机制与作用。方法:(1)分离、培养大鼠纤维环细胞并传代,观察其形态及生物学特性,通过甲苯胺蓝染色,倒置相差显微镜对细胞表型进行鉴定。(2)取第1代生长良好的细胞制成单细胞悬液后种培养皿或6孔板,培养箱继续培养1天后分为实验组与对照组,实验组置于可控压力培养装置中在1MPa压力下分别培养12h、24h、36h、48h,对照组置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养48h。(3)采用JC-1荧光染色,流式细胞仪检测线粒体膜电位去极化水平反映线粒体损伤程度;用红色荧光降低百分比表示线粒体膜电位降低。(4)MDA、SOD试剂盒检测线粒体内MDA含量与SOD活性反应线粒体氧化应激水平。(5)取36h实验组与对照组用倒置相差显微镜观察对比细胞死亡数。(6)WesternBlot检测细胞内自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B-I、LC3B-II的表达以反映细胞自噬水平。结果:(1)成功构建鼠纤维环细胞体外培养模型,细胞形态为梭形或多角形,原代细胞生长较慢,第1代与第2代生长较快,第3代及以后变慢。细胞呈甲苯胺蓝异染性,染色后倒置相差显微镜观察示胞核空泡状,典型者胞核蓝色,胞浆紫色,可见核分裂像。(2)对照组和实验组随着加压培养时间的延长(0h-48h),JC-1荧光染色示红光百分比越低,表明随着加压时间增加,线粒体损伤加重。(3)对照组和实验组随着加压培养时间的延长(0h-48h),MDA含量越高,SOD活性越低,表明随着加压时间增加,线粒体氧化应激水平增高。(4)倒置相差显微镜示36h实验组较对照组细胞死亡数明显增多。(5)对照组和实验组随着加压培养时间的延长(0h-48h),Beclin-1的表达水平越高,LC3B-Ⅰ/LC3B-Ⅱ的比值越低,表明随着加压时间增加,细胞自噬水平上升。结论:成功体外培养鼠纤维环细胞,表型鉴定符合纤维环细胞特征。压力促进鼠纤维环细胞线粒体损伤应激,细胞死亡率及细胞自噬水平增加,参与椎间盘退变的形成。压力应激导致纤维环细胞发生自噬及自噬性细胞死亡可能由线粒体损伤应激介导。