氮素是促进植物生长和作物生产力的重要大量营养素之一。植物已经进化出多种机制来适应氮素不平衡的状况。在农业系统中,为了满足日益增长的生产需求,世界各地都通过大量施用氮肥以最大限度地提高作物产量。2007年全球氮肥施用量为1.1亿吨。到2050年,预计将增加到1.25～2.36亿吨。然而,沉积在土壤中的很大一部分氮无法被植物吸收并流失到环境中,从而导致严重的环境污染和生态失衡。因此,通过发展高产农业来满足不断增长的世界人口的需求,同时保障棉花品质和环境质量,是一项巨大的挑战,而在减少氮肥施用的情况下培育高效利用氮肥的作物新品种是解决这一困境的关键。转录因子具有协调调节一组基因表达的能力,因此在少施甚至不施氮肥的情况下,通过调控该基因的表达来提高氮素利用效率,将是更经济有效的方法。课题组前期转录组数据显示:在低氮水平下,GhHHO2基因的转录水平在陆地棉根中显著上调。为清楚该转录因子是否参与棉花对低氮胁迫的响应过程,开展相关研究,获得如下结果:1、陆地棉GhHHO2基因的生物信息学分析首先从陆地棉中克隆了GhHHO2基因（Gh＿A12G1550）,生物信息学分析显示该基因位于第12号染色体上,含有一个1140 bp的开放阅读框,编码379个氨基酸残基,其蛋白分子量为41 k Da。在棉花数据库Cotton FGD中对HHO相关基因进行检索,共得到16个陆地棉同源基因。前人研究表明,拟南芥中共有6个HHO同源基因,将陆地棉与拟南芥HHO同源基因进行系统进化树分析显示,GhHHO2基因与陆地棉中的GhHHO3基因亲缘关系最近,与拟南芥中的At HHO2基因同源性最高。为了了解陆地棉HHO同源基因的表达模式,利用实验室陆地棉基因数字表达谱分析库进行检索,运用Heml软件进行了热图分析。结果表明,GhHHO2基因在根和25 d纤维中表达量相对较高,与其表达模式较相近的是GhHHO5基因（Gh＿A12G0642）。2、GhHHO2基因的表达特性分析利用Real-time PCR技术来探究GhHHO2基因在棉花生长过程中的表达特性。结果显示,GhHHO2基因在根中表达量最高,在萼片和子叶中表达量较高,在10DPA胚珠中表达量最低。用不同浓度梯度硝酸盐营养液处理棉花幼苗,结果表明低浓度硝酸盐能诱导GhHHO2基因的表达,并且在根中的诱导作用更明显。当用不同氮源处理棉花幼苗时,发现在高浓度铵盐培养条件下,棉花根部明显变黄,受到了铵毒害。而GhHHO2基因的表达量相对于硝酸盐处理出现明显上调,猜测GhHHO2基因可能在铵毒害的解除过程中也发挥一定的作用。运用Plant Care网站对GhHHO2基因启动子序列进行顺式作用元件预测,发现PGhHHO2序列中含有丰富的激素反应、光反应和胁迫反应等六类元件,表明GhHHO2基因与植物的这些生长发育过程密不可分。为了确认GhHHO2基因在拟南芥中的表达模式,将其2911 bp启动子序列与GUS报告基因融合,并对p BI121-PGhHHO2::GUS转基因拟南芥植株进行组织化学染色。结果显示,在转基因拟南芥的叶片、侧根以及根毛中都有非常明显的GUS染色信号,在腋芽、花苞和莲座叶中也有GUS基因表达。又将转基因拟南芥进行不同供氮水平以及不同氮源的水培处理,染色结果与Real-time PCR检测的GhHHO2基因的表达模式基本一致。为了更好地了解GhHHO2基因的功能,构建了p LGN-35S-GhHHO2::e GFP和p LGN-35S-e GFP::GhHHO2表达载体,在烟草叶片中进行瞬时表达,与核染料DAPI共定位后发现,GhHHO2基因定位在细胞核上。通过VIGS沉默棉花的GhHHO2基因,在低氮胁迫下表现出比对照组更明显的缺氮表型,其叶绿素a、叶绿素b含量都显著低于对照组,表明VIGS沉默GhHHO2基因后叶片中叶绿素合成受到了一定程度的影响。3、异源表达GhHHO2基因增加了拟南芥植株对低氮胁迫的耐受性将GhHHO2基因在拟南芥中进行异源表达,选择表达量比较高的3个转基因拟南芥株系和野生型拟南芥在不同硝酸盐浓度下进行水培培养,观察并比较表型差异。发现在硝酸盐缺乏（1 m M、3 m M）培养条件下,3个转基因株系比野生型的生长旺盛,随着硝酸盐浓度的增加,转基因株系和野生型之间生长势差异逐渐缩小。根系性状统计表明,GhHHO2转基因拟南芥植株在硝酸盐缺乏条件下可以显著增加主根长度,特别是在硝酸盐浓度较低的条件下差异更明显;而在氮充足（10 m M）条件下,转基因植株和野生型主根长度并无显著差异。以上数据表明,低氮胁迫下异源表达GhHHO2基因可增加转基因拟南芥植株的主根长度,有利于维持根系对氮素的吸收,增加植株中的氮含量,从而在一定程度上提高植株对低氮胁迫的耐受性。4、超量表达和基因编辑GhHHO2基因对棉花生长发育的影响为了进一步研究超量表达和基因编辑GhHHO2基因对棉花对氮素利用情况的影响,构建了超量表达和基因编辑的植物表达载体并转化棉花,经筛选获得转基因棉花植株。首先测定了野生型与T0代两种转基因棉花中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量。结果显示,与野生型棉花相比,超量表达转基因棉花植株的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量基本都是上调的;而基因编辑转基因棉花植株的叶绿素a、叶绿素b含量基本都是下调的,类胡萝卜素含量没有一致的变化。表明GhHHO2基因的表达水平对棉花植株叶绿素的合成有着一定的影响。又测定了野生型和转基因棉花氮代谢过程中几种关键酶的活性,结果表明在正常供氮情况下,超量表达GhHHO2基因对亚硝酸还原酶（Ni R）、Fd-谷氨酸合酶（Fd-GOGAT）的活性具有一定的促进作用。为了探究超量表达和基因编辑GhHHO2基因对棉花植株中硝态氮或铵态氮的积累是否有影响,测定了野生型和两种转基因棉花叶片中硝态氮和铵态氮的含量。发现两种转基因棉花硝态氮和铵态氮的含量基本无差异,均低于野生型。推测产生这种情况的原因可能是由于在超量表达棉花中的氮代谢作用增强,同化了更多的硝态氮和铵态氮;而在基因编辑棉花中只对GhHHO2基因进行了编辑,可能存在其他功能互补的同源基因被诱导表达增加,从而产生了与超量棉花一致的结果。