【摘 要】
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脲酶（EC 3.5.1.5）是人类发现的第一种含镍金属酶,可以催化尿素最终水解生成铵和碳酸盐,目前生物矿化领域应用最多的产脲酶菌主要是巴氏芽孢八叠球菌。但是,截至目前为止,关于野生八叠球菌分子改造的报道少见。通过亚硝基胍化学诱变选育八叠球菌脲酶高产菌株的工作具有随机性且工作量非常大。因此,选择合适的脲酶基因簇和表达系统,结合蛋白质工程手段和分子生物学手段实现脲酶的高效表达具有重要的意义。本研究旨在
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脲酶（EC 3.5.1.5）是人类发现的第一种含镍金属酶,可以催化尿素最终水解生成铵和碳酸盐,目前生物矿化领域应用最多的产脲酶菌主要是巴氏芽孢八叠球菌。但是,截至目前为止,关于野生八叠球菌分子改造的报道少见。通过亚硝基胍化学诱变选育八叠球菌脲酶高产菌株的工作具有随机性且工作量非常大。因此,选择合适的脲酶基因簇和表达系统,结合蛋白质工程手段和分子生物学手段实现脲酶的高效表达具有重要的意义。本研究旨在挖掘不同来源的脲酶基因资源,并比较脲酶基因在不同原核系统中表达的酶活力,通过启动子优化、密码子优化等策略构建了高效重组脲酶工程菌。主要研究内容和结果如下:（1）巨大芽孢杆菌脲酶基因簇在大肠杆菌中实现异源表达。将来源于巨大芽孢杆菌的脲酶基因簇ure ABCEFGDB.me进行密码子优化后构建表达载体p ET28a-ure ABCEFGDB.me,然后转化到大肠杆菌,重组酶的SDS-PAGE凝胶电泳图谱和Nano LC-ESI-MS/MS蛋白质谱分析结果证明该脲酶的七个亚基全部实现表达,重组脲酶活力达到304±15 U/L。（2）摩氏摩根氏菌脲酶基因簇及尿素转运蛋白基因I与脲酶基因簇在大肠杆菌的异源表达。从野生摩氏摩根氏菌基因组中扩增出脲酶基因簇ure ABCEFGDM.mo以及尿素转运蛋白基因ure IM.mo,构建p ET28a-ure ABCEFGDM.mo和p ET28a-ure ABCEFGDIM.mo表达载体,转入不同的大肠杆菌表达菌株。目标蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图谱和Nano LC-ESI-MS/MS质谱分析显示摩氏摩根氏菌脲酶的七个亚基全部表达,但是,在大肠杆菌中蛋白大部分以包涵体的形式存在。含有尿素转运蛋白基因的重组菌株BL21（DE3）/p ET28a-ure ABCEFGDIM.mo酶活力最高,达到4500±240U/L。（3）摩氏摩根氏菌脲酶基因簇及其尿素转运蛋白基因I在枯草芽孢杆菌中的共表达。以枯草芽孢杆菌作为底盘生物,将摩氏摩根氏菌来源的ure ABCEFGDIM.mo作为靶标基因,构建重组表达载体p HT254-ure ABCEFGDIM.mo。电转化筛选得到枯草芽孢杆菌AS1/p HT254-ure ABCEFGDIM.mo重组菌株。重组蛋白的SDS-PAGE和Nano LC-ESI-MS/MS质谱分析结果表明,摩氏摩根氏脲酶基因簇的7个亚基皆实现可溶性表达。其中,重组菌AS1/p HT254-ure ABCEFGDIM.mo的酶活力达8665±300U/L,该酶活力是靶标脲酶基因簇大肠杆菌重组菌的1.93倍,是原始摩氏摩根氏菌脲酶活力的4倍,结果表明枯草芽孢杆菌是合适的表达脲酶的原核表达系统。（4）巴氏芽孢八叠球菌脲酶基因簇在枯草芽孢菌中的表达。以枯草芽孢杆菌AS1为底盘细胞,改造实验室构建保存、具有较高脲酶活力的巴氏芽孢八叠球菌脲酶的表达载体p HT254-ure ABCEFGDS.pa的表达元件。采用重叠延伸PCR策略将启动子更换成p43、全质粒PCR策略在ure F前添加RBS序列。构建重组载体电转化枯草芽孢杆菌AS1,筛选得到枯草芽孢杆菌AS1/p HT254-p43-ure ABCEFGDS.pa重组菌株,该重组菌株的脲酶活力达到15880±370 U/L。场发射扫描电子显微镜以及X射线衍射技术对微生物诱导形成的晶体沉淀表征,结果显示沉淀成分主要为化学性质稳定的方解石,具有潜在的应用价值。
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