大蒜病毒多重RT-PCR检测技术优化及大蒜中新病毒序列的鉴定

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大蒜(Allium sativum L.)属于百合科葱属,是一种在世界范围内广泛栽培的蔬菜,具有独特的风味和很高的药用价值。大蒜主要依靠鳞茎进行无性繁殖,这种繁殖方式导致病毒在大蒜的鳞茎积累,对大蒜造成危害。培养脱毒大蒜需要快速准确的病毒检测方法,以便确定病毒感染状况和脱毒效果。目前,大蒜病毒的逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测方法大多是针对一种或几种单一病毒,且对大蒜中新发现病毒的研究较少。本研究以大蒜中常见的青葱X病毒属病毒(Allexiviruses)、香石竹潜隐病毒属病毒(Carlaviruses)和马铃薯Y病毒属病毒(Potyviruses)为对象,建立了检测大蒜这三个属相关病毒的三重RT-PCR体系,并对三重RT-PCR体系的Mg2+浓度,d NTP浓度,引物浓度,Taq酶浓度和退火温度进行了优化。同时,我们用转录组测序,RT-PCR以及c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA ends,RACE)PCR的方法,对中国黄冈大蒜病样中发现的一种新的凹陷病毒属病毒的全基因组序列进行了测定。该病毒的基因组RNA(Gen Bank accession MT981417)全长8748个核苷酸,不包括3’末端poly(A)尾巴,包含5个开放阅读框(open reading frames,ORFs)。这些ORFs编码病毒复制酶,一个三重基因模块(triple gene block,TGB)和外壳蛋白(CP)。该病毒暂定名为大蒜黄条纹相关病毒(garlic yellow stripe associated virus,Gar YSa V)。蛋白质序列的Pairwise比对表明,Gar YSa V编码的蛋白质与其他凹陷病毒属病毒蛋白的相似性低于47.2%,这表明它是凹陷病毒属的一个新种。复制酶和CP氨基酸序列的系统发育分析同样表明,Gar YSa V属于凹陷病毒属。通过共聚集显微镜观察发现,Gar YSa V CP蛋白定位于细胞核与细胞外周;TGB1蛋白定位于细胞核、细胞外周和叶绿体;TGB2蛋白在细胞质中聚集;TGB3蛋白定位于细胞外周,并在胞间连丝附近聚集。据我们所知,这是在单子叶植物中凹陷病毒属病毒的首次报道。综上所述,我们建立了一个针对大蒜中Allexivirus、Carlavirus和Potyvirus三个属病毒的三重RT-PCR检测体系。从大蒜中扩增了一种新的凹陷病毒属病毒的全基因组序列,对该病毒序列进行了生物信息学分析,并探究了该病毒CP蛋白和TGB蛋白在烟草细胞中的定位。
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