研究目的和背景结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一。近年来,随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变,结直肠癌的发生率和死亡率也呈现逐渐上升趋势。结直肠癌的演进是多因素、多水平、多通路的复杂过程。随着医疗水平的进步,除了常规手术、化疗外,针对性的靶点治疗提高了结直肠癌患者的生存率及生存质量。因此,筛选其发生、转移相关基因并阐明其相关分子机制,将对临床结直肠癌的诊断、预防、治疗具有重要意义。近十年来,越来越多的研究发现ErbB家族在许多肿瘤中起着重要的作用,如乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、结肠癌等；并成为许多肿瘤的重要候选治疗靶点之一(Hynes and Lane,2005). ErbB家族(EGFR家族)属于I型受体酪氨酸激酶超家族,是一类具有跨膜结构的酶蛋白,包括EGFR/ErbB1/HER1 ErbB2/Neu/HER2、ErbB3/HER3、ErbB4/HER44个成员(Hynes and Lane,2005)。EGFR---典型的酪氨酸激酶受体(RTK),也被称为Her1、ErbB1,突变或过表达一般会引发肿瘤,是目前结直肠癌治疗最有意义的分子靶点之一。但是,近来某些临床实验逐渐发现EGFR靶向治疗对大多数结直肠癌患者效果不明显(Cunningham et al.,2004; Cunningham et al.,2006; Rothenberg et al., 2005; Zhang et al.,2007)。ErbB2又称为Her-2/neu、lien,或P185,在乳腺癌中常存在异常扩增,在结直肠癌中也有部分过表达(Kluftinger et al.,1992;Maurer et al.,1998).最近研究发现ErbB3也可能成为针对结直肠癌的一个潜在靶点(Lee et al.,2009)。在某些结直肠癌患者的临床标本中也检测到ErbB4的表达(Kountourakis et al.,2006)。值得一提的是,膜ErbB4的阳性表型可作为结直肠癌复发的一个独立预后因素(Kountourakis et al.,2006);且ErbB4也参与了结肠的损伤与炎症(Frey et al.,2009; Frey et al.,2010)及结直肠癌相关的癌前病变。但是目前关于ErbB家族成员比如ErbB3. ErbB4在结直肠癌中的具体作用仍然不是很清楚。我们知道许多细胞因子参与了ErbB家族成员的调节。某些生长因子配体如：EGF、TGF-α、Neuregulin1可作为正向调节子激活ErbB受体(Citri and Yarden,2006)。此外,研究发现两条机制参与了ErbB信号的负调控。其中一条是通过ErbB家族的受体降解；另一条是通过与受体相互作用的分子蛋白来结合配体蛋白。重要的是,这些蛋白可能是结直肠癌治疗的潜在靶点。两组研究发现在肿瘤的发生展中ErbB调节子起着重要的作用；Lrigl是一个反向pan-ErbB调节子；也是一个重要的肿瘤抑制基因(Powell et al.,2012; Wong et al.,2012).促肝细胞再生磷酸酶-3(phosphatase of regenerating liver-3, PRL-3),属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族(PRL-1、PRL-2、PRL-3)成员之一,其蛋白的相对分子量约为19-21KD,通过调节酪氨酸残基的磷酸化状态实现对蛋白质活性的调控。PTP酶可以通过酪氨酸的去磷酸化和磷酸化调节细胞的生长、分化、细胞周期、细胞间信息传递和其他活动。PRL-3在正常结直肠上皮中几乎不表达,在原发性结直肠癌肿瘤组织中不表达或低表达,而在结直肠癌转移灶(尤其是肝脏)中高表达。PRL-3与人结直肠癌的发生、进展、转移及预后密切相关。PRL-3参与多种信号通路的调节如AKT/PI3K信号通路、Wnt信号通路、Ras信号通路等,从而影响细胞的增殖、分化、凋亡等。Erbin即ErbB2结合蛋白,LAP(leucine-rich repeats and PDZ domains, LRRs And PDZ)家族重要成员之一,是参与ErbB信号的一个重要蛋白,对上皮细胞极化起着重要作用(Bilder D et al.,2000)。Erbin C-端含PDZ结构域(Tzahar E et al.,1996),能与非磷酸化ErbB2蛋白结合,调节ErbB2的功能与定位(David B et al.,2000;Borg et al.,2000)。尽管如此,Erbin在肿瘤的发生发展中的作用仍然不清楚。为了进一步了解PRL-3在结直肠癌发生发展转移中的机制,我们猜想PRL-3是否参与了EGFR信号的调节呢?而抗EGFR抗体生物制剂目前已经应于结直肠癌的辅助化疗,那么PRL-3在结直肠癌中的作用是否与EGFR信号相关呢?我们通过研究发现二者存在相互作用,且ErbB2相互作用蛋白Erbin随着PRL-3的改变而改变明显,因此我们猜想是否PRL-3与Erbin存在相互作用呢?接下来我们通过细胞模型、双向小鼠异种移植模型、Erbin突变小鼠研究了Erbin在结直肠癌ErbB信号中的作用。方法1、Westernblotting检测PRL-3敲低对EGFR信号的影响选取生长状态良好的结直肠细胞株SW480及HCT116,瞬时敲低PRL-3后,提取细胞全蛋白,Western Blot分析PRL-3、EGFR家族及Erbin蛋白的表达。2、检测Erbin在结直肠癌中的表达结直肠癌的分期和分型根据国际抗癌联盟(UICC)及美国肿瘤联合会(AJCC)的标准来进行。本研究中病患均经手术切除后病理确诊。随机获取新鲜人结直肠癌组织及配对正常结肠组织石蜡包埋后4μm切片,免疫组织化学染色检测Erbin的表达(4μm石蜡切片常规二甲苯脱蜡(7-10min/3times)→梯度酒精水化(100%无水乙醇Ⅰ、100%无水乙醇Ⅱ、95%无水乙醇Ⅰ、95%无水乙醇Ⅱ、90%无水乙醇、85%无水乙醇、80%无水乙醇、75%无水乙醇、70%无水乙醇)→0.01M,pH6.0枸橼酸缓冲液抗原修复(高压修复3min)→0.02M,pH7.2-7.4 PBS洗2min×3times→3%H2O2室温孵育10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性→0.02M,pH7.2-7.4 PBS洗3min×3times→兔抗人Erbin多克隆抗体(1：200稀释)4℃过夜→0.02M,pH7.2-7.4 PBS洗3min×3times→羊抗兔HRP标记二抗室温30min→0.02M,pH7.2-7.4 PBS洗3min×3times→ DAB显色→苏木素复染→0.1%盐酸分化→PBS返蓝→常规脱水透明→中性树脂封片。Erbin蛋白为细胞胞浆表达；设立阴性对照(PBS取代一抗)及空白对照)；免疫组化检测结直肠癌组织芯片中Erbin的表达,芯片包含了患者的临床病理资料(年龄、姓别、肿瘤的大小和范围、浸润深度、有无淋巴结转移、远处转移等),免疫组织化学染色的强度和定位等由病理科两位专家在不知患者病理特点的情况下独立评估。Erbin在细胞内的表达根据光镜下半定量结果判断标准,按细胞着色评分：棕褐色3分；棕黄色2分；淡黄色1分；无着色0分。按着色细胞的数量评分：相对于整个肿瘤面积着色细胞：0分(0%),1分(1-25%),2分(26-50%),3分(51-75%)、4分(76-100%)。最后以两者相乘(分值范围0-12)所得值为总的评分值;Western Blot分析不同人结直肠癌细胞株中Erbin的表达,Western Blot分析人结直肠癌组织与其配对正常粘膜组织中Erbin的表达,Westen Blotting分析不同Dukes分期新鲜结直肠癌组织中Erbin的表达(各取30gg细胞全蛋白或组织蛋白50μg,与2×SDS-PAGE上样缓冲液以1：1体积混合,瞬时离心后100℃加热10min,冰上lmin,冷却瞬时离心后上样,6%SDS-PAGE凝胶电泳,采用预染蛋白Marker为参照。电泳至溴酚蓝距底部0.5cm左右即停止电泳,PAGE胶上的蛋白质用Bio-Rad微型电转移系统于4℃、300mA电转移120min至PVDF膜上。用镊子小心取出PVDF膜,观察Marker已完全转移至膜上,5%脱脂牛奶PBST室温封闭1.5小时,兔抗人Erbin抗体(1：350稀释)4℃C孵育过夜；PBST洗膜3次,每次5 min,加入HRP标记的羊抗兔二抗(1：5000稀释)室温孵育l h,PBST洗膜5次,每次5 min。膜稍滴干后加入化学发光试剂孵育1 min,迅速在化学发光仪中曝光1mmin左右获取图像,以β-actin或α-Tublin为内对照)。3、Erbin过表达和表达敲低对结直肠癌细胞生物学特性的影响设计人Erbin特异性引物,克隆至重组逆转录病毒表达载体pLNCX2,应用PCR、酶切及DNA测序进行鉴定,确认后转染GP2-293细胞株,获得病毒上清后,感染结直肠癌细胞SW480及SW620,通过药物G418筛选后,应用Q-PCR检测细胞中Erbin mRNA表达及Western Blot检测检测细胞内Erbin蛋白的表达；获得Erbin稳定过表达人结直肠癌细胞株SW480-Erbin. SW620-Erbin及对照细胞株SW480-Empty (SW480-mock)、SW620-Empty (SW620-mock)。设计人Erbin基因特异性RNAi靶序列,转染人结直肠癌细胞株HT29,应用Western Blot检测不同干扰片段对Erbin蛋白表达的影响,选取干扰效率最高的片段亚克隆至慢病毒载体,构建Erbin敲低稳定表达载体,转染入293FT细胞,获取病毒上清,检测病毒滴度,加入人结直肠癌细胞HT29及HCT116培养48小时后加入嘌呤霉素,通过Western Blotting鉴定获取Erbin稳定敲低人结直肠癌细胞株HCT116-Erbin-KD、HT29-Erbin-KD及对照细胞株HCT116-Erbin-NC、HT29-Erbin-NC。利用平板克隆形成实验检测Erbin过表达对结直肠癌细胞SW480、SW620体外增殖能力的影响及Erbin敲低后对结直肠癌细胞HT29、HCT116体外增殖的影响；应用运动小室实验检测Erbin过表达对结直肠癌细胞SW480、SW620运动和迁移能力的影响及Erbin敲低后对结直肠癌细胞HT29、HCT116迁移能力的影响；应用细胞粘附实验测定Erbin过表达对结直肠癌细胞SW480、SW620粘附能力的影响及Erbin敲低对结直肠癌细胞HT29、HCT116粘附能力的影响。利用悬浮干细胞培养基,培养干细胞球,检测Erbin过表达对结直肠癌细胞SW480、SW620干细胞球形成能力的影响及Erbin敲低后对结直肠癌细胞HT29、HCT116干细胞球形成能力的影响4、Erbin过表达和表达敲低对结直肠癌ErbB信号通路的影响获取Erbin稳定过表达或稳定敲低的结直肠癌细胞株细胞全蛋白,应用Western Blot、免疫荧光检测Erbin过表达或表达敲低对结直肠癌中ErbB信号通路及AKT等信号通路的影响。收集生长状态良好的Erbin稳定敲低的结直肠癌细胞株HCT116-Erbin-KD、HT29-Erbin-KD及对照细胞株HCT116-Erbin-NC、 HT29-Erbin-NC或稳定过表达的结直肠癌细胞株SW480-Erbin、SW620-Erbin及对照细胞株SW480-Empty、SW620-Empty, D-hanks液洗细胞沉淀3次,最后用D-hanks重悬细胞沉淀,调整细胞浓度为2×107cells/ml,各取100μ1皮下注射入裸鼠颈部及大腿两侧,每3天观察皮下瘤形成,并记录皮下瘤的体积,3周后结束实验,比较皮下瘤的大小并将获得的皮下移植瘤放入10%中性福尔马林固定,石蜡包埋切片,进行免疫组织化学染色或将获得的新鲜皮下移植瘤采用液氮研磨法提取全蛋白,应用Western Blot实验来分析Erbin过表达或表达敲低形成的皮下瘤中Erbin的表达及形成的皮下瘤Erbin过表达或表达敲低对ErbB信号通路及AKT等信号通路的影响。5、Erbin PDZ结构域突变对结直肠上皮ErbB信号通路的影响利用pGT2Lxf质粒载体通过基因诱捕技术获得的Erbin突变(Erbinl-693βgal) ES细胞株,将此细胞株转移到小鼠囊胚。然后将嵌合体杂交到C57/B16小鼠,通过杂交获得Erbin PDZ结构域突变纯合子小鼠(ErbinΔC/Δ)、杂合子小鼠(Erbin+/ΔC)、野生型小鼠(Erbin+/+)。获得ErbinΔC/ΔC小鼠和Erbin+/+小鼠新鲜结直肠组织,通过组织冰冻切片免疫荧光染色及Western Blot分析Erbin PDZ结构域突变对ErbB相关信号通路的影响；将ErbinΔC/ΔC小鼠和Erbin+/+小鼠结直肠组织,10%中性福尔马林固定,石蜡包埋切片,免疫组织化学染色分析Erbin PDZ结构域突变对ErbB相关信号通路的影响。ErbinΔC/ΔC小鼠和Erbin+/+小鼠按体重O.1ml/10g经腹腔注射10mM,pH7.4, BrdU2小时后,断颈处死小鼠获得新鲜小肠及结肠组织,小心剪开皮肤及皮下组织,暴露腹腔,小心钝性分离出腹腔内组织,剪取结直肠端组织,剪开后,生理盐水中清洗干净,放入组织包埋盒内,做好标记；10%中性福尔马林固定,24小时后,取出包埋盒,清水冲洗沥干后进行梯度脱水,在包埋机上包埋后制作4μm切片,放入烤箱中60℃烘烤一小时后,4℃保存备用。4μm石蜡切片常规二甲苯脱蜡(7分钟/次,共3次),梯度酒精水化(100%无水乙醇Ⅰ、100%无水乙醇Ⅱ、95%无水乙醇Ⅰ、95%无水乙醇II、90%无水乙醇、85%无水乙醇、80%无水乙醇、75%无水乙醇、70%无水乙醇),0.01M,pH6.0枸橼酸缓冲液抗原修复(高压修复3min),3%H202去离子水,室温孵育10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性；加入一抗(按比例稀释)4℃℃孵育过夜；羊抗兔HRP标记二抗室温30min,DAB显色,苏木素复染,0.1%盐酸分化,流水下返蓝,常规脱水透明,中性树脂封片。6、Erbin PDZ结构域突变小鼠AOM诱导通过AOM诱导ErbinΔC/ΔC小鼠和Erbin+/+小鼠,建立Erbin突变相关的结直肠腺瘤模型,选取6-8周龄的同窝ErbinΔC/ΔC小鼠和Erbin+/+小鼠,性别随机,称重,按10mg/kg腹腔内注射AOM。同时设置生理盐水组。每日观察小鼠的生活状态并称重,在AOM注射3月和6月后处死小鼠,观察小肠、结直肠有无腺瘤形成,及腺瘤形成的数目,测量腺瘤的体积。断颈处死小鼠,小心剪开皮肤及皮下组织,暴露腹腔,小心钝性分离出腹腔内组织,剪取结直肠端组织,剪开后,生理盐水中清洗干净,观察结直肠有无腺瘤形成,记录腺瘤的大小,将部分新鲜ErbinΔC/ΔC小鼠和Erbin+/+小鼠肠腺瘤组织,放入组织包埋盒内,做好标记；将获得的腺瘤通过冰冻切片免疫荧光染色及Western Blot分析ErbinPDZ结构域突变小鼠形成的腺瘤Erbin及ErbB相关信号通路的关系；或者将腺瘤组织用10%中性福尔马林固定,石蜡包埋切片,免疫组织化学染色分析ErbinPDZ结构域突变小鼠形成的腺瘤Erbin及ErbB相关信号通路的关系。7、免疫共沉淀和westernblotting分析Erbin对EGFR信号的调节机制生长状态良好的细胞经EGF或MGl32或3-MA处理后,获得细胞全蛋白,通过免疫共沉淀和免疫印记分析Erbin对EGFR的泛素化作用。结果1、结直肠癌细胞株中PRL-3对EGFR信号的影响Western Blot结果发现结直肠癌细胞株SW480瞬时敲低PRL-3后,Erbin的表达明显增强、EGFR及磷酸化EGFR蛋白的表达水平也明显增加,有意义的是,ErbB3及ErbB4的表达也出现增加趋势,而ErbB2蛋白的表达无明显改变。2、Erbin在结直肠癌细胞及组织中的表达通过不同的肿瘤临床标本发现,在肝细胞癌、肝胆管细胞癌、乳腺癌、肺腺癌、肺鳞状上皮细胞癌、结肠腺癌中均有不同程度的表达；在肺鳞状上皮细胞癌及肝细胞癌中表达较低；在乳腺癌及结肠癌中表达较高。免疫组织化学检测结直肠癌配对组织芯片,结果发现Erbin主要定位于胞浆；在正常结肠粘膜中表达较弱或不表达；在结肠癌组织中部分表达较弱,部分表达较强,较强处可见少数细胞核表达。Erbin的表达与年龄、性别、肿瘤的大小、肿瘤分化、肿瘤的浸润范围表达差异无统计学意义(P>0.05)；但是,我们发现Erbin的表达与结直肠癌患者淋巴结转移(χ2=4.001,P=0.045)、Dukes分级(χ2=4.523,P=0.033)、TNM分期(χ2=6.674,P=0.010)之间差异有统计学意义。Western Blot方法发现在不同的结直肠癌细胞株中Erbin的表达存在差异：在结直肠癌细胞株HCT116及HT29中Erbin高表达；在LS174T及Lovo细胞株中中度表达；在SW480及SW620细胞株中低表达。在随机挑选的8对结直肠癌组织及其配对正常粘膜组织的Western Blot结果中发现Erbin表达在原发结直肠癌组织中明显高于其配对正常粘膜组织。在进一步对不同Dukes分期的新鲜结直肠癌组织进行Western Blot检测发现Dukes C期更容易检测到Erbin的表达,即Dukes C期Erbin的表达较高。3、Erbin稳定过表达或Erbin稳定干扰对结直肠癌细胞的生物学特性影响通过酶切及DNA测序成功构建重组逆转录病毒载体pLNCX2/Erbin,转染结直肠癌细胞SW480及SW620,并成功获得Erbin稳定过表达人结直肠癌细胞株SW480-Erbin. SW620-Erbin及对照细胞株SW480-Empty (SW480-mock)、 SW620-Empty (SW620-mock)。通过RNAi技术沉默结直肠癌细胞株Erbin表达,成功建立Erbin基因稳定敲低的结直肠癌细胞株HCT116-Erbin-KD、 HT29-Erbin-KD及对照细胞株HCT116-Erbin-NC、HT29-Erbin-NC。平板克隆形成实验结果发现Erbin稳定敲低的结直肠癌细胞株HCTll6细胞(F=67.688,P=0.001)、HT29细胞(F=139.471,P=0.000)细胞克隆形成能力显著下降,Erbin过表达结直肠癌细胞株SW480细胞(F=59.645,P=0.002)、SW620细胞(F=12.986,P=0.023)细胞克隆形成能力明显增强,差异具有显著的统计学意义。粘附实验结果表明,Erbin稳定敲低后人结直肠癌细胞株HCTll6细胞(F=17.305,P=0.003)、HT29细胞(F=5.986,P=0.040)黏附能力显著下降,Erbin过表达后人结直肠癌细胞株SW480细胞(F=104.26,P=0.000)、SW620细胞(F=9.339,P=0.016)黏附能力明显增强,差异具有显,著的统计学意义。Transwell小室迁移实验表明,Erbin稳定敲低后人结直肠癌细胞株HCTll6细胞(F=233.065,P=0.000)及HT29细胞(F=276.416,P=0.000)细胞的运动迁移能力明显减弱,差异具有显著的统计学意义。干细胞球形成实验结果发现HCTll6细胞(P=0.000)及HT29细胞(P=n000)Erbin敲低后细胞形成的干细胞球体积明显减小,差异具有显著的统计学意义。SW480细胞(P=0.000)及SW620细胞(P=0.004)Erbin过表达后形成干细胞球大小较对照组明显增大,差异具有统计学意义。4、体外或体内敲低Erbin对结直肠癌细胞ErbB信号通路的影响通过细胞免疫荧光实验及Western Blot分析结果发现在HT29细胞及HCTll6细胞敲低Erbin后,ErbB家族成员(EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4)的表达明显降低；使用特异性磷酸化抗体发现EGFR、ErbB3、ErbB4的磷酸化蛋白水平表达也降低,而磷酸化ErbB2的表达明显增加。同时Western Blot结果还发现下调细胞HT29及HCT116 Erbin蛋白的表达,ErbB下游信号AKT及ERK表达水平无明显改变,但是p-AKT及p-ERK的表达水平明显下调。利用已构建的Erbin稳定敲低细胞株通过裸鼠异体细胞皮下注射,成功建立裸鼠皮下移植瘤模型,结果发现Erbin表达下调的细胞株HT29(F=21.315,P=0.000)及HCT116(F=5.669,P=0.029)其皮下肿瘤的生长明显减慢；Western Blot分析Erbin及ErbB相关信号的表达,结果发现Erbin敲低细胞株形成的皮下瘤Erbin表达明显下调,相对应的一个(HCT116细胞EGFR)或多个(HT29细胞EGFR、ErbB3、ErbB4) ErbB家族成员表达也下调；ErbB信号下游靶点p-AKT、p-ERK蛋白表达随Erbin表达下调而下调。免疫组织化学观察皮下瘤Erbin及ErbB信号的表达,结果与体外实验一致：Erbin表达下调,ErbB家族成员(EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4)蛋白水平表达也随之降低,有的甚至未检测到(ErbB3)。Erbin敲低后形成的皮下瘤中Ki-67的表达也明显减弱。5、体内或体外过表达Erbin对结直肠癌细胞ErbB信号通路的影响细胞免疫荧光及Western Blot分析结果发现结直肠癌细胞株SW480、SW620过表达Erbin后,ErbB家族成员EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4表达均表达增强,同时发现ErbB信号下游靶点p-AKT及p-ERK表达明显增强,但AKT及ERK表达无明显变化。利用已构建的Erbin过表达细胞株通过裸鼠异体细胞皮下注射,成功建立裸鼠皮下移植瘤模型,结果发现Erbin过表达细胞株SW480(F=5.366,P=0.033)及SW620(F=5.132,P=0.036)Erbin表达上调,其皮下肿瘤的形成及生长能力明显增强。提取各组皮下瘤组织蛋白,Western Blot发现Erbin表达上调后,ErbB家族成员(EGFR、 ErbB3、ErbB4)表达均增加,ErbB2变化趋势不明显；进一步研究发现ErbB信号下游靶点p-AKT、p-ERK蛋白表达随Erbin表达上调而上调。免疫组织化学观察皮下瘤Erbin及ErbB信号的表达,结果发现Erbin表达上调,ErbB家族成员(EGFR、ErbB3、ErbB4)蛋白水平表达也上调,但处理前后均难以观察到ErbB2的表达。Erbin过表达后,其皮下瘤中Ki-67的表达也呈增强趋势。6、Erbin PDZ结构域突变对小鼠结直肠上皮ErbB信号通路的影响通过基因诱捕技术获得Erbin PDZ结构域突变小鼠(ErbinΔC/ΔC小鼠)即Erbin基因C-端PDZ结构域由β-gal基因插入替代,以模仿内源性Erbin表达(Erbinl-693βgal)。免疫组织化学染色、免疫荧光染色及Western Blot分析发现Erbin PDZ突变小鼠肠粘膜上皮Erbin表达明显下调,同时ErbB家族成员的表达也发生明显改变,主要表现为Erbin PDZ突变后EGFR、ErbB3、ErbB4表达缺陷,在Erbin PDZ突变前后,仅能检测到ErbB2弱表达。Western Blot分析发现Erbin PDZ突变小鼠肠上皮表达磷酸化AKT,但是免疫组织化学染色未检测到；同时Western Blot分析还发现Erbin PDZ突变小鼠肠上皮磷酸化ERK表达明显下调。免疫组织化学染色还发现Erbin PDZ突变小鼠肠上皮β-catenin、Ki-67表达明显受抑制。对Erbin突变小鼠进行BrdU腹腔内注射,发现肠上皮BrdU阳性细胞数表达明显下调。7、AOM诱导Erbin PDZ结构域突变小鼠对肿瘤发生发展的影响通过AOM腹腔注射ErbinΔC/ΔC小鼠和Erbin+/+小鼠,成功诱导结直肠腺瘤的发生,诱导后3月后发现大部分Erbin突变小鼠(ErbinΔC/ΔC或HO)未发生腺瘤,而Erbin无突变小鼠(Erbin+/+或WT)大部分在结肠远端肉眼可见小腺瘤；AOM诱导后6月,Erbin突变小鼠结直肠中下段肉眼可见较小且少量的腺瘤,与Erbin突变小鼠相比Erbin无突变小鼠结直肠发生的腺瘤较大,且数目增多,差异具有统计学意义(p<0.05)。腺瘤组织HE染色显微镜下观察发现Erbin无突变小鼠比Erbin突变小鼠的腺瘤更具有侵袭性,不典型增生明显,甚至突破基底膜,在粘膜下层也可见异型增生的小细胞团。ErbinΔC/ΔC小鼠AOM诱导发生腺瘤的不典型性较Erbin+/+小鼠相比明显减弱,差异具有统计学意义(p<0.05)。注射生理盐水后ErbinΔC/ΔC小鼠和Erbin+/+小鼠均无腺瘤发生。免疫组织化学分析ErbinΔC/ΔC小鼠和Erbin+/+小鼠的腺瘤组织,结果发现与Erbin+/+小鼠的腺瘤相比,ErbinΔ/ΔC小鼠的腺瘤Erbin表达明显减弱,且ErbB家族成员EGFR、 ErbB3、ErbB4也呈现表达下调趋势。同样地,AKT、ERK、β-ERK、β-cateninKi-67表达明显下调。免疫荧光染色及Western Blot分析结果发现与Erbin+/+小鼠的腺瘤相比,ErbinΔC/ΔC小鼠形成腺瘤其Erbin及ErbB家族成员EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4表达明显下调；p-AKT、p-ERK的表达也明显下调。8、Erbin通过阻断EGFR-c-cbl相互作用抑制EGFR泛素化在结直肠癌细胞株SW480和SW620中,Erbin表达上调,EGFR表达均上调,而ErbB2在SW480细胞中无明显改变,在SW620细胞中表达上调；在过表达Erbin及干扰ErbB2表达后,发现EGFR表达均与未处理时相比表达上调,而ErbB2表达下调。这些结果表明Erbin调节EGFR信号表达不受ErbB2蛋白的影响。在结直肠癌细胞株HCTll6和HT29中,EGF刺激后,Erbin表达无明显改变,但EGFR发生明显降解；在EGF刺激下,下调Erbin表达,EGFR表达也下调；蛋白酶抑制剂MGl32处理后可以逆转Erbin下调对EGFR的影响,且不受EGF的影响；自噬抑制剂3-MA同样可以逆转Erbin对EGFR的效应,且也不受EGF的影响,但是,这种逆转作用明显低于MG132的影响。这些结果表明Erbin对EGFR信号的影响主要是通过泛素化调节来实现。在HCTll6细胞中,Erbin表达下调可以导致EGFR泛素化活性增强；Erbin表达上调,EGFR的泛素化作用明显受抑制。在HCTll6细胞中,当Erbin表达下调时,免疫共沉淀EGFR发现c-cbl蛋白明显表达上调；而当Erbin表达上调时,免疫共沉淀EGFR发现c-cbl蛋白表达明显下调甚至消失。有意思的是,免疫共沉淀分析发现Erbin与c-cbl存在直接相互作用。结论1、在结直肠癌细胞株中敲低PRL-3,激活EGFR信号,ErbB2无明显改变,Erbin蛋白明显增加,表明PRL-3可能通过Erbin来调节EGFR信号的活性,从而影响结直肠癌的发生发展。2、Erbin在结直肠癌中高表达,在正常结直肠肠上皮中低表达或不表达,Erbin表达与结直肠患者淋巴结转移、TNM分期、Dukes分期密切相关, Erbin可能是参与结直肠癌发生发展的一个新的基因,为结直肠癌的发生机制的研究提供一个新的方向。3、Erbin促进结直肠癌细胞克隆形成、黏附能力增强、运动能力增加、干细胞球形成能力增强,Erbin可能作为一个肿瘤促进基因参与结直肠癌的发生发展。4、Erbin表达下调抑制ErbB相关信号通路,Erbin表达上调激活ErbB相关信号通路,提示Erbin参与了ErbB相关信号的正向调节。5、Erbin PDZ结构域突变导致小鼠肠上皮ErbB相关信号缺陷,提示Erbin PDZ结构域在调节ErbB相关信号中起着十分关键的作用,通过调节ErbB相关信号影响其下游靶点的活性,从而影响细胞的生长、分化、增殖。6、首次成功建立了AOM诱导的Erbin PDZ突变小鼠结直肠癌动模型,AOM诱导Erbin PDZ突变小鼠抑制肠上皮腺瘤的发生和发展；Erbin在结直肠癌中是一个关键的正向ErbB信号调节基因,其PDZ结构域是结直肠癌发生发展的关键决定因素；Erbin在结直肠癌中的作用举足轻重,有望Erbin能成为结直肠癌治疗的一个新的靶点。7、在EGF作用下,EGFR通过与c-cbl相互作用发生泛素化,从而使EGFR降解；Erbin通过与c-cbl相互作用阻断EGFR与c-cbl的相互作用,而抑制EGFR泛素化,从而抑制EGFR降解,激活EGFR信号通路,促进肿瘤的发生发展。