研究背景胶质瘤是神经系统最常见的恶性肿瘤,其在颅脑肿瘤中所占的比例高达44.69%。近几十年来在胶质瘤治疗领域各国均进行了深入研究,治疗的主流手段仍为手术,化疗和放射治疗。尽管部分患者能通过这些疗法有一定缓解,但从总体情况看胶质瘤的治愈率仍较低,复发率高,预后极差,中位生存约14个月。胶质瘤呈浸润性生长,常规手术很难找到其明显边界,术后复发率很高；大部分脑胶质瘤细胞对放疗、化疗不敏感,手术创伤及放化疗对机体免疫力又产生抑制和破坏。氩氦冷冻治疗技术是近年源自美国氩氦冷冻治疗设备而兴起的一种低温冷冻技术。利用高科技手段和航天材料制成的带有微细刀头的氩氦冷冻设备,可在计算机的控制下,利用冷热逆转的原理,达到破坏肿瘤的作用。即高压氩气经过冷冻刀传导,短时间内(10-20秒)在刀尖部位形成-140℃的超低温,形成似梭形冰块冷冻组织,肿瘤细胞瞬间形成冰晶体而死亡。复温时,高压氦气达到刀头时迅速升至45℃,肿瘤细胞内的冰晶体在这一温度下快速解冻而导致细胞裂解,对肿瘤细胞产生二次攻击,达到彻底破坏肿瘤组织的作用,而整个过程刀杆基本保持常温。由于操作简单、安全,对病人创伤小,此项治疗技术发展迅速,已应用于临床各组肿瘤疾病,包括肝、肾、胰腺癌、前列腺癌和肺癌各种组织,是很有前途的技术。近几年国内外大量基础和临床研究发现冷冻治疗技术不仅能直接杀伤肿瘤,其冷冻后的肿瘤细胞能作为抗原增强术后抗肿瘤免疫能力,引发继发性的冷冻免疫反应。近来的研究表明,这一机制与抗原递呈细胞(Antigen presenting cells, APC)有关。目前认为,肿瘤经冷冻破坏后,细胞膜融解破裂,从而促使细胞内和处于遮蔽状态的抗原释放,抗原递呈细胞(APC)通过识别、加工、处理肿瘤抗原并将其信息提供给T细胞,发生冷冻免疫效应。树突状细胞(dendritic cells, DC)是目前所知体内功能最强的抗原呈递细胞(APC),具有摄取、处理抗原的能力,如肿瘤特异性抗原、肿瘤相关性抗原及完全性细胞抗原。经过修饰的DC通过把抗原加工成肽,载入第二类主要组织相容性复合(MHC Class Ⅱ)分子运送到细胞表面,依赖于共刺激信号和T细胞受体(TCR)抗原的识别,如T细胞上的CD28识别DC上的B7.1(CD80)分子或B7.2(CD86)分了,激活特异性T细胞,激发初次细胞免疫应答。同时成熟DC分泌的白细胞介素(如白介素12,IL-12)等免疫因子,通过诱导T细胞分化为细胞毒性T淋巴细胞(CTL),调节细胞介导的免疫反应；另外IL-12还可促进T和NK细胞的增殖,提高单核细胞的细胞毒性,通过各种途径杀伤肿瘤细胞。近年来,对树突状细胞(DC)的深入研究不仅促使了基础免疫的进展,而且使其在肿瘤免疫治疗中的作用越来越受到重视,以DC为基础的主动免疫疗法已成为当今肿瘤生物治疗的热点之一。其原理为应用各种抗原致敏DC使其成为细胞疫苗再回输体内,通过有效激发机体免疫系统产生强烈的抗肿瘤免疫应答而达到治疗肿瘤的目的,该疗法已成为肿瘤生物治疗的又一新兴手段。目前用来“装载"DC的抗原有死亡的肿瘤细胞、细胞裂解物、凋亡体、纯化的蛋白质和抗原肽,质粒cDNA等。由于胶质瘤具异质化的特性,即胶质瘤中的各种瘤细胞在侵袭能力、生长速度、分化程度、对激素的反应、对抗癌药物的敏感性等方面均有所不同,使得胶质瘤特异性抗原的纯化分离相当困难。且最适当的宿主抗肿瘤的T细胞反应需要一系列的抗原决定簇,而不是仅仅局限于某一个抗原决定簇。不断有研究表明,利用冷冻制备肿瘤抗原,能诱导出肿瘤特异性的或针对多个抗原表位的T细胞反应,在临床应用中无需鉴定肿瘤抗原表位及患者人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA);诱导出的针对肿瘤细胞多靶位的多克隆免疫应答,抗原性更强,能够有效地防止由于抗原变异而引起的免疫逃避。目前,将肿瘤冷冻抗原作为树突状细胞致敏物,所制备的树突状细胞肿瘤疫苗已成功运用于多种其他肿瘤的实验研究中。除此之外,我们认为利用氩氦冷冻制备的肿瘤冷冻抗原DC疫苗还有制备简便、效果显著、应用安全的优势。中枢神经系统很长时间内被认为是免疫豁免区,这主要和存在血脑屏障(BBB)和缺乏淋巴系统有关。现有证据表明,中枢神经系统的免疫豁免不是绝对的,在一定程度上说,脑组织仅是免疫原性低下的器官,在多种病理情况下,血脑屏障受到破坏而开放,淋巴细胞可以进入中枢神经系统发挥免疫作用。因此,免疫反应可以介入中枢神经系统疾病,这为中枢神经系统肿瘤的免疫治疗奠定了理论基础。本研究选用大鼠C6胶质瘤细胞系作为研究对象,首先,氩氦冷冻体外C6胶质瘤细胞悬液,制备成肿瘤全细胞冷冻抗原。然后,利用全细胞冷冻抗原,致敏Wistar骨髓源性树突状细胞(DC),形成树突状细胞(DC)疫苗；最后,建立C6/Wistar大鼠颅内胶质瘤模型,采用DC疫苗对其进行治疗,观察DC疫苗对荷脑胶质瘤大鼠的疗效。目的：建立大鼠C6胶质瘤细胞系,常规双循环氩氦冷冻法制备全细胞冻融抗原。方法：选择大鼠C6胶质瘤细胞系,应用含血清培养基(DMEM/F12+10%FBS)培养足量胶质瘤细胞。收集对数期生长的细胞制成大鼠C6胶质瘤细胞悬液,无菌状态下,常规双循环氩氦冷冻法制备大鼠胶质瘤全细胞冻融抗原,并于-20℃冷冻保存备用。结果：大鼠C6胶质瘤细胞在含血清培养基中呈贴壁生长,长出突起,呈短梭形、长梭形、星形、长纤维形；这些胶质瘤细胞经胰酶消化制备成PBS悬液于离心管内,常规氩氦冷冻法制备大鼠C6胶质瘤细胞时,开启氩气能在冷冻探针顶部形成一定范围的冰球,近似口宽底窄的梭形,开启氦气时冰球溶解。循环冷冻消融时再次形成冰球并溶解。结论：采用氩氦冷冻设备体外冷冻C6胶质瘤细胞悬液,方法简单、经济。可通过控制氩氦冷冻设备的参数,获取大量理想的全细胞冻融抗原,既能在直观下观察冷冻的过程,又为下一步研究DC疫苗准备了足够的冷冻抗原。目的：建立Wistar大鼠骨髓源性树突状细胞(DC)的分离和培养方法,观察经氩氦冷冻后C6胶质瘤细胞冻融产物对wistar大鼠骨髓源性树突状细胞(BM-DC)成熟的影响,了解致敏树突状细胞(DC)对荷C6脑胶质瘤Wistar大鼠的治疗作用。方法：设计双循环氩氦冷冻法冻融体外C6胶质瘤细胞悬液为实验组,只插入探针不作冷冻为阴性对照组,双循环氩氦冷冻法冻融等量PBS为空白对照组；取wistar大鼠骨髓单核细胞,加入含40ng/mL重组大鼠白细胞介素-4(rmlL-4)40ng/mL重组大鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基培养。采用贴壁法纯化。培养6天时加入100ng TNF-a,第7天时分别加入各组冷冻产物(按制备冻融抗原前肿瘤细胞数量与DC数量3：1的比例),48小时后光镜下观察DC细胞形态；收集细胞,流式细胞仪检测各组DC细胞表面共刺激分子CD80和CD86指数,ELISA法检测各组上清液中IL-12含量；立体定向下建立荷脑C6胶质瘤Wistar大鼠模型,分别于第3、10天于大鼠皮下注射各组致敏的DC,采用Kaplan-Meier和Log-rank分析比较各组大鼠中位生存期。结果：培养第9天的DC(加入冻融产物48小时),实验组具有成熟DC形态学特征,表面分子CD80、CD86阳性表达率、培养细胞上清中IL-12的分泌量高于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；实验组DC疫苗治疗的荷脑胶质瘤大鼠中位生存期高于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：胶质瘤氩氦冻融产物可以诱导树突状细胞(DC)成熟,介导大鼠脑胶质瘤的免疫治疗,为冷冻免疫机制提供一定的理论基础,同时为胶质瘤个体化治疗的研究提供一种新的思路。