IgA肾病(IgAN, IgA nephropathy)又称Berger’s病,是一组以肾小球系膜区IgA沉积,同时伴系膜细胞增生和系膜基质扩张为主要病理改变的原发性肾小球肾炎。IgAN临床表现多样,即可表现为无症状性血尿或蛋白尿,也可表现为急,慢性肾衰竭等严重肾脏受损表现。与临床表现的多样性相似,IgA肾病患者肾组织病理改变也多种多样。IgA肾病是目前全球范围内最常见的一种原发性肾小球肾炎,我国是IgA肾病的高发地区,据报道IgA肾病占肾活检患者的39.55%。以往认为IgA肾病预后良好,但大量临床研究显示在10-20年内10%-20%患者将不可避免地持续进展至ESRD。如何预防和治疗IgA肾病是肾内科医生不容回避的一个问题。腭扁桃体粘膜免疫与IgAN肾脏损伤存在密切的关系。IgAN患者尿检恶化常常在上呼吸道感染后发生。扁桃体切除联合激素冲击治疗较单纯激素冲击治疗明显改善患者血尿和蛋白尿,减少肾脏系膜区IgA沉积和系膜区增生,保护肾功能。多项研究证明,IgAN患者扁桃体存在多方面的异常：在结构上,扁桃体隐窝上皮异常网状化；在受到外界抗原刺激后,IgAN患者扁桃体存在过强的免疫反应,不仅有免疫细胞种类失衡,且分泌产物异常。如受到副流感嗜血杆菌等的刺激后,研究者发现扁桃体T淋巴细胞聚集的小区和主要由小T淋巴细胞构成的小结节增大,扁桃体免疫调节功能过度活化,导致B细胞过度刺激,滤泡外增殖,分泌多聚IgA的扁桃体淋巴细胞增加。这种绞链区低糖基化的IgA分子与系膜区沉积的IgA分子特征相同,为扁桃体与肾脏系膜损伤之间的关系提供了依据。IgAN患者的腭扁桃体单个核细胞(Tonsillar Mononuclear Cells, TMCs)分泌产物的异常已被多项研究证实。在外来抗原如副流感嗜血杆菌抗原(OMHP)等刺激后,IgAN患者TMCs对抗原的刺激反应过强,分泌如TGF-β, IL-10, IFN-γ等细胞因子增加,刺激B细胞过度增殖,产生更多的生产IgA的浆细胞。活性氧是指机体内由氧形成的,含氧且化学性质活泼的物质的总称,最主要的有两种含氧的自由基：超氧阴离子和羟自由基。过多的活性氧可以通过氧化DNA,蛋白质,多元不饱和脂肪酸,尤其是脂质的过氧化造成生物损伤。现代研究显示,包括IgAN在内的多种疾病与活性氧损伤有关。通过对IgAN患者肾活检标本和动物实验研究表明IgAN肾内活性氧-肾素-血管紧张素轴在肾脏损伤早期阶段已激活并且在肾脏损伤方面发挥作用。腭扁桃体单个核细胞分泌产物是否造成肾小管上皮细胞活性氧水平增加和氧化应激反应,损伤肾小管上皮细胞目前缺乏报道。我们的研究收集IgAN患者和非肾炎慢性扁桃体炎患者(Chronic Tonsillitis, CT)手术切除的右侧腭扁桃体,分离TMCs培养,收集培养上清液作用于人肾小管上皮细胞株(HK-2),测定其超氧阴离子型活性氧水平的同时观察HK-2细胞凋亡水平及凋亡相关因子bcl-2,进一步观察TGF-β1对人肾小管上皮细胞株(HK-2)超氧阴离子型活性氧水平和凋亡的影响,从而探索扁桃体影响肾小管上皮细胞的途径,为进一步研究保护肾小管上皮细胞的策略打下基础。本研究共分为三部分。第一部分IgAN人TMCs培养上清对人肾小管上皮细胞株(HK-2)超氧阴离子型活性氧的调控及凋亡的影响目的观察IgA肾病人TMCs培养上清对体外培养的人肾小管上皮细胞株(HK-2)超氧阴离子型活性氧水平及凋亡的影响,探讨IgA肾病TMCs上清是否可通过超氧阴离子型活性氧损伤肾小管上皮细胞,造成小管上皮细胞凋亡。方法一、IgAN和非肾炎CT患者TMCs培养上清对人肾小管上皮细胞株(HK-2)超氧阴离子型活性氧水平的影响：分别收集10例IgAN和非肾炎慢性扁桃体炎患者(chronic tonsillitis, CT)手术摘除的右侧腭扁桃体,分离TMCs,分成四组进行培养：1.IgAN+组：IgAN患者TMCs加入PHA (10μg/mL)培养72hr；2. IgAN-组：IgAN患者TMCs不加PHA培养72hr；3.非肾炎CT+组：CT患者TMCs加入PHA(10μg/mL)培养72hr；4.非肾炎CT-组：CT患者TMCs不加PHA培养72hr。体外培养72小时后,收集四组rMCs培养上清液,按20%的浓度加入人肾小管上皮细胞株(HK-2)培养12hr,同时设置HK-2细胞的0.5%胎牛血清的低糖DMEM培养组作为阴性对照组(Con组),用流式细胞仪测定各组HK-2细胞二氢乙啶(DHE)(反映活性氧,尤其是超氧阴离子型活性氧水平)荧光强度。二、IgAN+TMCs培养上清对HK-2细胞凋亡的影响以及与超氧阴离子型活性氧的关系：IgAN患者TMCs加入PHA(10μg/mL)培养72小时,收集上清液。将HK-2细胞分成三组：1.阴性对照组：0.5%胎牛血清的低糖DMEM培养HK-2细胞；2. IgAN+组：20%PHA刺激的IgAN TMCs上清液培养HK-2细胞24hr；3. IgAN+&SOD组：20%PHA刺激的IgAN TMCs上清液与Cu/Zn SOD (100units/mL)共同加入HK-2细胞培养24hr。用流式细胞仪检测各组HK-2细胞AnnexinV, Propidium Iodide(反映凋亡水平)荧光强度,台酚蓝染色测定活细胞数,计算细胞存活率。结果一、IgAN和非肾炎CT患者TMCs培养上清对肾小管上皮细胞株(HK-2)超氧阴离子型活性氧水平的影响：对比于阴性对照组(Con组)DHE水平(100±0),IgAN+组HK-2细胞DHE水平为194.06±16.75, IgAN-组HK-2细胞DHE水平为166.72±10.24,非肾炎CT+组HK-2细胞DHE水平为111.23士14.64,非肾炎CT-组HK-2细胞DHE水平为104.18±11.25。IgAN+组HK-2细胞DHE水平较阴性对照组(Con组),IgAN+组,非肾炎CT+组,非肾炎CT-组高,差异具有统计学意义(p<0.01)。IgAN-组较Con组,非肾炎CT+组,非肾炎CT-组HK-2细胞DHE水平高,差异具有统计学意义(p<0.01)。二、IgAN+TMCs培养上清对HK-2细胞凋亡的影响以及与超氧阴离子型活性氧的关系：IgAN+组HK-2细胞凋亡率27.66%±5.50%,较阴性对照组(Con组)HK-2细胞凋亡率(11.08%±2.35%)高,差异具有统计学意义(p<0.01)。IgAN+&SOD组HK-2细胞凋亡率16.33%±4.49%,较IgAN+组低,差异具有统计学意义(p<0.01),较Con组高,差异具有统计学意义(p<0.01)。直接用台酚蓝检测活细胞计数的办法统计细胞存活率得出：IgAN+组TMCs培养上清加入HK-2细胞共培养24hr后较对照组能减少其细胞存活率(71.8%±4.65%vs97%±.33%)(p<0.01),加入SOD的IgAN+&SOD组(83.7%±3.84%)较IgAN+组能增加细胞存活率(p<0.01)。结论1.PHA刺激和未刺激的IgAN患者TMCs培养上清液与HK-2细胞共培养后能增加HK-2细胞超氧阴离子型活性氧水平；2.PHA刺激的IgAN患者的TMCs培养上清液增加HK-2细胞凋亡率,抑制超氧负离子型活性氧能部分减轻IgAN TMCs培养上清对HK-2细胞凋亡的影响。第二部分IgAN人TMCs培养上清对人肾小管上皮细胞株(HK-2)超氧阴离子型活性氧调控的时间规律及对bcl-2,p53的调控目的观察IgAN人TMCs培养上清与人肾小管上皮细胞株(HK-2)共培养后超氧阴离子型活性氧水平的时间变化规律以及人肾小管上皮细胞株(HK-2) bcl-2, p53水平变化与超氧阴离子型活性氧的关系。方法一、IgAN人TMCs培养上清对HK-2细胞超氧阴离子型活性氧调控的时间规律：IgAN人TMCs加入PHA (10μg/mL)培养72hr,收集上清液,按20%浓度加入肾小管上皮细胞株(HK-2)。分别在加入上清液0hr,1hr,3hr,6hr和12hr流式细胞仪测定HK-2细胞DHE荧光强度。二、IgAN人TMCs培养上清对HK-2细胞bcl-2,p53的调控及与超氧阴离子型活性氧关系：2.1IgAN人TMCs培养上清对HK-2细胞bcl-2,p53的调控：IgAN人TMCs加入PHA(10μg/mL)培养72hr,收集上清液,按20%浓度加入肾小管上皮细胞株(HK-2)。分别在加入上清液培养0hr,3hr和12hr提取HK-2细胞总蛋白,western blotting测定bcl-2和p53蛋白水平。2.2超氧阴离子型活性氧对HK-2细胞bcl-2,p53调控：将人肾小管上皮细胞株(HK-2)分成三组：1.阴性对照组：HK-2细胞加入0.5%胎牛血清的低糖DMEM培养；2. IgAN+组：PHA (10μg/mL)刺激的IgAN TMCs培养上清按20%浓度加入培基与HK-2细胞共培养；3. IgAN+&SOD组：PHA刺激的IgAN TMCs培养上清20%与Cu/ZnSOD (100units/mL)一起加入HK-2细胞培养。各组HK-2细胞培养12hr提取总蛋白,Western Blotting测bcl-2,p53蛋白水平。结果一、IgAN人MCs培养上清对HK-2细胞超氧阴离子型活性氧调控的时间规律：PHA刺激的IgAN人TMCs上清在加入HK-2细胞0-3hr内HK-2细胞的DHE水平逐渐增加,3hrDHE水平增加到最高(290.48±43.94),(与其他各组比p<0.01),之后逐渐下降,培养12hr HK-2细胞活性氧水平降到3hr的55%(150.39±43)。二、IgAN人TMCs培养上清对HK-2细胞bcl-2, p53的调控及与超氧阴离子型活性氧关系：PHA刺激的IgAN人TMCs培养上清液加入HK-2细胞3hrHK-2细胞bcl-2较Ohr无变化,12hr bcl-2蛋白明显减少；加入SOD能减轻IgAN人TMCs上清对bcl-2的负调节。p53在整个过程中无明显变化。结论1.PHA刺激的IgAN人TMCs培养上清液作用于HK-2细胞0-3hr内HK-2细胞超氧阴离子型活性氧水平逐渐增加,加入上清液后3hr达到最高,3hr后随时间增加下降；2.PHA刺激的IgAN人TMCs培养上清液作用于HK-2细胞3hrHK-2细胞bcl-2水平无明显变化,作用12hrbcl-2明显减少,加入SOD抑制超氧阴离子型活性氧能明显减轻IgAN人TMCs上清对bcl-2的负调节；3.PHA刺激的IgAN人TMCs上清液作用于HK-2细胞0-12hrHK-2细胞p53无明显变化,加入SOD亦不能明显改变p53。第三部分IgAN人TMCs培养上清与人肾小管上皮细胞株(HK-2)共培养上清TGF-β1蛋白表达及外源性TGF-β1对HK-2超氧阴离子型活性氧及凋亡影响目的观察PHA刺激的IgAN人TMCs培养上清液作用于HK-2细胞后共培养上清液TGF-β1的水平变化以及对比于IgAN患者TMCs上清液,外源性TGF-β1对HK-2细胞超氧负离子型活性氧水平及细胞凋亡的调控。方法一、IgAN人TMCs培养上清与人肾小管上皮细胞株(HK-2)共培养上清液TGF-β1的水平变化：将人肾小管上皮细胞株(HK-2)分成三组：1.阴性对照组：加入0.5%胎牛血清的低糖DMEM培养液培养24hr；2. IgAN+组：加入20%PHA刺激的IgAN TMCs培养上清液培养24hr；3.非肾炎CT+组：加入20%PHA刺激后的非肾炎CTTMCs养上清液共培养24hr。用ELISA双抗体夹心法测定各组HK-2细胞共培养上清液的TGF-β1水平。二、外源性TGF-β1对人肾小管上皮细胞株(HK-2)超氧阴离子型活性氧及细胞凋亡的影响：将HK-2细胞分成四组：1.阴性对照组(Con组)：加入0.5%胎牛血清的低糖DMEM培养液；2. IgAN+组：加入20%PHA刺激后的IgAN人TMCs培养上清液；3.TGF-β1组：加入TGF-β1(5ng/mL);4.TGF-β1&SOD组：加入TGF-β1(5ng/mL)+SOD(100units/mL)。各组HK-2细胞培养12hr后用流式细胞仪测定DHE荧光强度,各组培养24hr测定%AnnexinV(+)凋亡水平。结果一IgAN人TMCs培养上清与人肾小管上皮细胞株(HK-2)共培养上清液TGF-β1的水平变化：阴性对照组HK-2细胞培养液TGF-β1为21.76±1.89ng/L,IgAN+组共培养液TGF-β1为1162.76±162.13ng/L,非肾炎CT+组共培养液TGF-β1为314.81±43.79ng/L。IgAN+组与阴性对照组和非肾炎CT+组比较,共培养液的TGF-β1水平高,有统计学意义(p<0.01)。非肾炎CT+组与阴性对照组比较,共培养液TGF-β1水平高,有统计学意义(p<0.01)。二、外源性TGF-β1对入肾小管上皮细胞株(HK-2)超氧阴离子型活性氧及细胞凋亡的影响：IgAN+组DHE荧光强度为173.12±8.47,TGF-β1组DHE荧光强度为193.34±20.36,两组与阴性对照组比较,HK-2细胞荧光强度(100±0)强,均具有统计学意义(p<0.01)。TGF-β1&SOD组DHE荧光强度为121.4±7.27,较TGF-p1组低,有统计学意义(p<0.01)TGF-β1组HK-2细胞凋亡率为30.72%±4.22%, IgAN+组HK-2细胞凋亡率为36.34%±3.22%,TGF-β1&SOD组HK-2细胞凋亡率为24.96%±2.56%。TGF-β1组HK-2细胞凋亡率比阴性对照组(16.74%±1.25%)高,差异具有统计学意义(p<0.01),比IgAN+组低,有统计学意义(p<0.05)。TGF-β1&SOD组细胞凋亡率比TGF-β1组低,差异具有统计学意义(p<0.01)。结论1.PHA刺激的IgAN人TMCs上清液加入HK-2细胞能增加共培养液的TGF-β1水平；2.外源性TGF-β1加入HK-2细胞能增加HK-2细胞超氧阴离子型活性氧水平及凋亡率,TGF-β1介导的HK-2细胞凋亡能被SOD部分抑制。