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目的：脑胶质瘤（gliomas）是颅内最常见的原发性恶性肿瘤，具有发病率、复发率、死亡率高和治愈率低的特点。由于脑胶质瘤呈浸润性生长，手术治疗无法将其完全切除，手术后联合放射治疗是目前脑胶质瘤的首选治疗方法。但脑胶质瘤对射线不敏感或放射治疗一段时间后对射线敏感性降低，放射增敏剂可提高射线对肿瘤细胞的杀伤作用，增强放疗疗效。因此，研制高效的放射增敏剂并阐明其作用机制、靶点，对提高脑胶质瘤的治愈率具有重要意义。NO是最有效的肿瘤放射增敏分子。在缺氧条件下，NO能提高瘤细胞对射线的敏感性，但其对人体具有明显的神经毒性作用。目前认为放射增敏剂主要的作用机制为：促进肿瘤细胞调亡、引起细胞周期阻滞于对射线敏感的G2或G1期、引起细胞自噬性死亡、影响信号传导通路等。CpG ODN（CpG oligodeoxynucleotides）是含有未甲基化CpG基序的寡核苷酸片段，是细菌DNA产生免疫刺激作用的最小单位。近年来，CpG ODN作为新的放射增敏剂备受关注。实验结果认为CpG ODN的放射增敏作用与活化NK细胞、诱导肿瘤细胞分泌NO、TNF-α有关。本实验是国家“重大新药创制”科技重大专项“放射增敏剂候选药物CpG ODN107的研究”（2009ZX09103-051）的研究内容之一。以自主研发的CpG ODN107为研究对象，探讨CpG ODN107对人脑胶质瘤U87细胞的放射增敏作用并阐明其阐明其作用机制，为寻找高效、低毒的放射增敏药物奠定实验基础，同时也为脑胶质瘤治疗提供新的思路。研究内容及方法：一、CpG ODN107增强U87细胞放射敏感性的体内外生物学活性研究1．体外放射增敏作用研究（1）MTT法测定不同剂量的β射线(0、2、4、6、8、10Gy)对U87细胞活力的影响；不同浓度的CpG ODN107(1、3、10、30、90μg/mL)对U87细胞活力的影响；CpG ODN107联合射线对U87细胞活力的影响（2）集落形成法评价CpG ODN107联合射线对U87细胞增值能力的影响2．体内放射增敏作用研究（1）建立人脑胶质瘤U87细胞皮下移植瘤裸鼠模型，评价CpG ODN107联合射线对移植瘤的生长抑制及肿瘤生长延迟时间的影响（2）建立人脑胶质瘤U87细胞原位移植瘤裸鼠模型，评价CpG ODN107联合射线对裸鼠生存期的影响二、CpG ODN107联合射线对U87细胞增殖与死亡的影响1．流式细胞术观察CpG ODN107联合射线对U87细胞周期的影响2．流式细胞术观察CpG ODN107联合射线对U87细胞凋亡的影响3．CpG ODN107联合射线对U87细胞自噬的影响（1）透射电镜法观察CpG ODN107联合射线对自噬体形成的影响（2）Western blot检测CpG ODN107联合射线对自噬标志蛋白LC3和beclin-1表达的影响（3）免疫荧光观察CpG ODN107联合射线对U87/GFP-LC3细胞绿色荧光聚集的影响三、CpG ODN107对细胞信号转导通路的影响1．CpG ODN107对TLR9/NF-κB信号转导通路的影响（1）Griess法检测U87细胞NO生成（2）ELISA法检测U87细胞iNOS蛋白表达（3）Real time-PCR检测TLR9mRNA表达（4）ELISA法检测U87细胞NF-κB活化2．CpG ODN107对HIF-1α/VEGF信号转导通路的影响（1）免疫组化法检测脑胶质瘤组织CD34蛋白表达，通过测量内皮细胞表面抗原CD34来计量微血管密度（2）ELISA法检测U87细胞VEGF蛋白表达、脑胶质瘤组织VEGF蛋白表达（3）Western blot法检测U87细胞HIF-1α蛋白表达、免疫组化法检测脑胶质瘤组织中HIF-1α蛋白表达研究结果：一、CpG ODN107对人脑胶质瘤U87细胞具有放射增敏作用研究1．10μg/mL CpG ODN107能显著提高U87细胞对β射线敏感性2．10μg/mL CpG ODN107联合射线（5Gy，7MeV）能显著抑制U87细胞活力及增殖能力3．1.7、5、15mg/kg CpG ODN107分别联合单次大剂量射线（10Gy）对U87细胞裸鼠皮下移植瘤生长具有明显的抑制作用，其抑制率分别为27.3%、67.0%和65.5%；同时能够显著延长其TGD和TVQT。4．0.75,0.25and0.083mg/kg CpG ODN107分别联合大剂量射线（10Gy）能延长原位移植瘤模型裸鼠的中位生存时间（23d、28d、37.5d）。其中，0.083mg/kg的CpGODN107联合单次大剂量射线（10Gy）能显著延长原位移植瘤裸鼠的生存期二、CpG ODN107对人脑胶质瘤U87细胞周期、凋亡、自噬的影响1．CpG ODN107联合射线可使U87细胞周期阻滞于G1期2．CpG ODN107联合射线不能促进U87细胞凋亡3．CpG ODN107联合射线可诱导U87细胞自噬（1）CpG ODN107联合射线可诱导U87细胞自噬体形成（2）CpG ODN107联合射线可上调自噬标志蛋白LC3和beclin-1的表达（3）CpG ODN107联合射线可诱导U87/GFP-LC3细胞绿色荧光聚集三、CpG ODN107对细胞信号转导通路的影响1．CpG ODN107对TLR9/NF-κB信号转导通路的影响（1）CpG ODN107联合射线可促使U87细胞NO生成（2）CpG ODN107联合射线可上调U87细胞iNOS蛋白的表达（3）CpG ODN107联合射线可上调U87细胞TLR9mRNA表达（4）CpG ODN107联合射线可诱导U87细胞NF-κB活化2．CpG ODN107对HIF-1α/VEGF信号转导通路的影响（1）CpG ODN107联合射线可下调脑胶质瘤组织CD34蛋白表达，降低脑胶质瘤组织微血管密度（2）CpG ODN107联合射线可下调U87细胞VEGF蛋白表达、下调脑胶质瘤组织中VEGF蛋白表达（3）CpG ODN107联合射线可下调U87细胞HIF-1α蛋白表达、下调脑胶质瘤组织中HIF-1α蛋白表达研究结论：1．CpG ODN107能增强人脑胶质瘤U87细胞对射线的敏感性体外实验结果表明，10μg/mL CpG ODN107联合射线能明显降低脑胶质瘤U87细胞活力及细胞增殖能力；体内实验结果表明，5mg/kg CpG ODN107联合射线对U87细胞裸鼠皮下移植瘤生长具有明显的抑制作用，其抑制率高达67.0%；0.083mg/kg的CpG ODN107联合单次大剂量射线能显著延长原位移植瘤裸鼠的生存期。2．CpG ODN107联合射线可诱导U87细胞阻滞于对射线较敏感的G1期，不能诱导细胞凋亡，但能诱导U87细胞自噬。提示，CpG ODN107发挥放射增敏作用与其诱导U87细胞G1期阻滞和诱导细胞自噬性死亡密切相关。3．CpG ODN107可显著增加人脑胶质瘤对射线的敏感性。其作用机制可能为TLR9/NF-κB途径介导U87细胞释放放射增敏分子NO；也可能是阻断HIF-1α/VEGF信号通路抑制肿瘤组织周围新生血管的形成。通过双重途径增强肿瘤细胞的放射敏感性，最终达到抑制肿瘤的生长、延长生存期的目的。