莽草酸是一种关键的中间体,能够合成抗流感药物达菲。莽草酸的代谢途径在大肠杆菌中已经得到了广泛的探索。本研究中,通过对地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)叠加敲除和过度表达代谢途径中的关键基因,提出了一种生产莽草酸的合理策略。地衣芽胞杆菌是一种具有莽草酸生产潜力的GRAS(公认安全)菌株,改造之后可以实现莽草酸的高产。通过敲除莽草酸激酶(Aro K)基因,阻断下游的代谢途径,使地衣芽胞杆菌WX-02开始积累莽草酸;敲除丙酮酸激酶(Pyk)基因,失活磷酸转移酶系统(PTS)葡萄糖特异性酶IICBA组分(Pts G)并过表达葡萄糖/甘露糖:H+转运体(Glc U);以及分别过表达转酮醇酶(Tkt)、3-脱氧-D-阿拉伯庚二酸-7-磷酸(DAHP)合酶(Aro A)、莽草酸脱氢酶(Aro D)与葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶(Zwf),莽草酸的产量得到了提高(其中产量最高为13.9 g/L),同时副产物的含量也大幅度减少。之后通过发酵培养基的正交试验进行优化,使菌株WX-02ΔarokΔpyk/p HY300-aro D的莽草酸产量(21.8g/L)相比于原始培养基提高了56.8%。本研究构建的生产莽草酸的工程菌株在发酵培养过程中,发酵液会在中后期逐渐变为深黑色,初步认为这种黑色的物质是黑色素。黑色素是一种氧化聚合物,由各种酚类或吲哚单体组成,合成途径与结构各异。目前为止,由微生物生产的黑色素仍没有被详细研究与报道。在本研究中,我们发现WX-02菌株在敲除莽草酸激酶(Aro K)基因后,发酵中才会产生黑色物质,说明本研究中的黑色素合成途径与aro K基因有密切关系。在通过酸碱抽提方法提纯黑色素后,对其进行紫外全波长扫描,得到的扫描曲线与文献报道中的结果一致。检测胞内氨基酸含量与进行补料添加实验后,发现芳香族氨基酸的消耗与黑色素的合成有关,其中苯丙氨酸与尿黑酸是黑色素合成的重要前体物。根据WX-02Δpyk与WX-02ΔarokΔpyk的转录组数据对比,构建了WX-02ΔarokΔpykΔtyr A与WX-02ΔarokΔpykΔphe A菌株,发现敲除tyr A基因(编码预苯酸脱氢酶)使黑色素产量较WX-02ΔarokΔpyk(5.42 g/L)提高了25.8%,为6.82 g/L;敲除phe A基因(编码预苯酸脱水酶)使黑色素产量下降了63.5%,为1.98 g/L。根据已有结果,我们分析本研究中黑色素很有可能为黑脓素(pyomelanin),并预测了以苯丙氨酸与尿黑酸为前体物的合成代谢途径。本研究揭示了一种新的用于莽草酸生产的GRAS平台,相关研究结果表明地衣芽胞杆菌同时也具有其他方向的发展潜力,可以进一步用于莽草酸代谢途径下游的芳香族化合物的生产与研究。