目的:造血干细胞(HSCs)的体外扩增一直是目前研究的热点和难点，近年来关于骨髓间充质干细胞(MSCs)促进HSCs增殖的研究较多。我们前期研究体内实验发现MSC促进骨髓增殖，同时发现血管增生明显，前期体外实验发现，MSC促进HSC增殖，Snoic hedgehog(Shh)协同MSC促进HSC的增殖。本研究将进一步探讨MSC促进HSC增殖是否与促血管生成因子有关，Shh协同MSC促进HSC增殖的机制。本研究可以为骨髓HSC体外扩增方面的深入研究提供依据，这对造血干细胞移植(HSCT)的发展及血液系统恶性疾病的治疗可能有着良好的应用前景。　　方法:①抽取健康志愿者的骨髓，根据MSCs贴壁生长的特点采用全骨髓培养法培养MSCs传至第三代(P3)，采用流式细胞术(FCM)，加用人抗鼠CD105-FITC、CD34-ECD、CD45-PCy7三种抗体鉴定MSC的纯度及表面标记。②抽取的骨髓采用密度梯度离心法获得单个核细胞(MNCs)，然后使用miniMASC磁珠分选仪分离CD34+细胞并通过计数板计数，加用人抗鼠CD34-ECD、CD45-PEcy7和人抗鼠IgG1-ECD、CD45-PEcy7，FCM检测HSCs纯度。③使用Transwell小室(上室微网孔径0.4um)非接触培养P3代的MSC及CD34+细胞，分为:HSC+MSC组和HSC组两组，每组3个复孔，培养3、7、10天分别收集HSC样本计数，发现培养7天时细胞增殖速度最快，故我们将培养第7天作为本研究的时间点。④使用Transwell小室及24孔板，非接触共培养及单独培养P3代的MSCs与骨髓CD34+细胞，并用Shh干预，分组如下:共培养分为:HSC+MSC组和HSC+MSC+Shh组，单独培养分为:HSC组、MSC组、HSC+Shh组、MSC+Shh组。⑤非接触共培养，在Transwell上、下室分别接种HSC和MSC，含Shh组，在Transwell的下室加入Shh蛋白，不含Shh组，则不加;单独培养组，在普通24孔板中分别加入与非接触共培养组相同数量的HSC或MSC，含Shh组，在24孔板中加入含Shh的培养基，不含Shh组，则不加;培养至7天收集样本。⑥检测HSC、MSC细胞计数、RNA总量、荧光定量PCR(Q-PCR)结果:先使用计数板计数各组三个复孔HSC和MSC的细胞数目;然后采用TRIZOL法提取各组三个复孔HSC和MSC RNA的含量;再将各组提取的RNA逆转录成cDNA放-20℃保存;最后利用实时荧光定量PCR法分别检测以下Q-PCR结果: HSC: Ki67、Tie-2，MSC: VEGF、Ang-1的mRNA水平的表达，Q-PCR结果使用2-△△Ct分析法来进行相对定量(RQ)分析。⑦实验数据统计:我们采用SPSS17.0软件统计分析实验中所获得的数据，两两比较采用单因素方差分析，计量资料均以“均数±标准差（x±SD）”表示，当P＜0.05时，则差异被认为具有统计学意义。　　结果:①全骨髓培养法分离培养的MSC，显微镜下可见MSC呈梭形，成旋涡状排列，贴壁生长;FCM鉴定P3代细胞的MSC，结果显示:MSCs高表达CD105，低表达CD34和CD45，比例分别为52.4％、2.2％、0.3％，MSCs的纯度为52.4％。②利用Mini MACS分离装置分选出的HSC，镜下呈圆形，流式鉴定结果显示CD34+细胞的纯度为81.9％。③培养HSC+MSC和HSC3、7、10天统计HSC的数量，HSC组10天＞7天＞3天，HSC+MSC组10天＞7天＞3天，HSC的计数均增加，在培养7天后，HSC计数增加速度最快，说明共培养最佳作用时间为第7天。④我们统计培养第7天各组HSC和MSC的计数。培养第7天，各培养组HSC的计数:HSC+Shh组、HSC+MSC组都高于HSC单独培养组;且HSC+MSC+Shh组高于HSC+MSC组;P值均＜0.05。各培养组MSC的计数:MSC+Shh组、MSC+HSC组都高于MSC单独培养组;且MSC+HSC+Shh组高于MSC+HSC组;P值均＜0.05。⑤培养第7天，采用TRIZOL法提取HSC和MSC RNA的含量。各组HSC的RNA总量:HSC+Shh组、HSC+MSC组都高于HSC单独培养组;且HSC+MSC+Shh组高于HSC+MSC组;P值均＜0.05。各培养组MSC的RNA总量:MSC+Shh组、MSC+HSC组都高于MSC单独培养组;且MSC+HSC+Shh组高于MSC+HSC组;P值均＜0.05。⑥培养第7天，利用Q-PCR法分别检测HSC的Ki67、Tie-2和MSC的VEGF、Ang1mRNA的相对表达量，即RQ值。Ki67的RQ值:HSC+SHH组、HSC+MSC组都高于HSC单独培养组;且HSC+MSC+Shh组高于HSC+MSC组;P值均＜0.05。Tie-2的RQ值:HSC+SHH组、HSC+MSC组都高于HSC单独培养组;且HSC+MSC+Shh组高于HSC+MSC组;P值均＜0.05。⑦培养第7天，各培养组MSC的VEGF的RQ值:MSC+SHH组、MSC+HSC组都高于MSC单独培养组;且MSC+HSC+Shh组高于MSC+HSC组;P值均＜0.05。Ang1的RQ值: MSC+SHH组、MSC+HSC组都高于MSC单独培养组;且MSC+HSC+Shh组高于MSC+HSC组;P值均＜0.05。　　结论:1.我们成功的分离培养出MSC、利用Mini MACS分离装置成功的分离培养出HSC;2.研究结果发现MSC能够促进HSC的增殖，Shh能够促进HSC的增殖，且Shh协同MSC促进HSC的增殖，本研究结果与前期研究一致;3.MSC促进HSC增殖的作用机制与血管生成因子有关;3.Shh促进HSC增殖的作用机制与血管生成因子有关;4.Shh促进MSC的增殖，其作用机制与血管生成因子有关;5.Shh协同MSC促进HSC增殖的作用机制与血管生成因子有关。