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目的恶性增殖和转移是包括胃癌在内的很多恶性肿瘤的特性,这些特性限制了肿瘤的治疗效果.近年研究发现,长链非编码RNA(lncRNAs)、微小RNA(miRNAs)等非编码RNA在细胞发育分化、细胞周期调控、基因转录等生理过程中发挥重要作用,其调控网络失衡在包括胃癌在内的恶性肿瘤病理进程中发挥了重要作用.因此,本研究拟从非编码RNA的角度,发现和解析胃癌细胞增殖和转移过程中的关键性调控分子及其调控机制,为寻找新的肿瘤标志分子和靶向干预分子,提高胃癌早期诊断率和降低转移率及胃癌未来的精准治疗做一些有益的探索.
方法芯片检测表明,4000个以上lncRNAs在胃癌及癌旁组织中的表达水平相差悬殊.选取其中8个差异表达量最高的lncRNAs,通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测其在多种胃癌细胞系和多例组织样本中的表达水平,确定目标lncRNA.目标lncRNA对胃癌细胞恶性生物学行为的影响通过以下方法进行检测:MTT掺入和EdU摄入实验检测细胞增殖,AnnexinV-PI双染后通过流式细胞仪检测细胞apoptosis水平的变化,铺胶或者不铺胶的tranwell实验检测细胞迁移和侵袭,裸鼠皮下荷瘤及尾静脉注射建立肺部转移模型检测目标lncRNA对胃癌细胞BGC-823成瘤性及体内转移的影响.进而,生物信息学分析预测可能与该lncRNA发生相互作用的miRNAs.通过荧光素酶报告实验和RNA富集实验确定该lncRNA调控的miRNA.结合生物信息在线分析和预测的结果,我们对该miRNA可能发挥调控作用的靶蛋白进行表达分析、互补结合分析和相应的生物学行为检测.继而,在动物样本和临床样本中,均通过westernblotting实验、进一步的免疫组织化学染色(IHC)进行靶蛋白的表达水平验证.最后,结合GCRL1、miRNA和靶蛋白在胃癌临床样本中的表达水平、改变其水平后肿瘤细胞生物学行为变化、相互调控关系,进行三者之间的相关性分析.
结果根据芯片检测,胃癌及癌旁组织中4000个以上表达水平相差悬殊的lncRNAs,其中变化最显著的8个,通过qRT-PCR方法,我们使用了26对胃癌组织样本进行表达验证,也在多种不同的胃癌细胞系中进行了表达水平检测,其中,lnc-RP11-290F20.3在细胞和组织均趋于增高.lnc-RP11-290F20.3是长链非编码RNALINC01272的异构体之一,但目前尚没有lnc-RP11-290F20.3在疾病中作用和机制的研究报道.基于其在胃癌中的表达特点,我们选择lnc-RP11-290F20.3进行进一步研究,并将其命名为胃癌相关的lncRNA-1(Gastric Cancer Related LncRNA1, GCRL1).对GCRL1功能和机制的探究大致分为以下六个部分.第一,GCRL1对胃癌细胞恶性生物学行为的影响,包含在不同细胞系中,细胞水平的增殖实验、凋亡检测和侵袭实验,也包含增殖和转移能力相关的裸鼠体内实验.该细胞增殖实验和transwell实验表明,在BGC-823细胞中抑制GCRL1的表达,可以明显抑制胃癌细胞的增殖、迁移和浸润,而在MGC-803细胞中增强GCRL1的表达,则能够显著促进胃癌细胞增殖、迁移和浸润,但对胃癌细胞凋亡的影响均不明显.裸鼠皮下荷瘤实验和裸鼠体内的肺转移模型表明,抑制GCRL1可以抑制肿瘤在动物体内的生长和转移潜能.第二,利用生物信息学软件和网站对GCRL1调控的靶miRNAs进行预测,在细胞和组织样本中进行靶miRNAs筛选,并通过荧光素酶报告实验(DLR实验)及RNA富集实验进一步表明GCRL1可以靶向调控miR-885-3p的表达.第三,miR-885-3p本身在胃癌细胞中的功能检测.该部分也包含了在不同细胞系中的增殖实验、凋亡检测和侵袭实验,也包含增殖和转移能力相关的裸鼠体内实验.该细胞增殖实验和transwell实验表明,在BGC-823细胞中提高miRNA-885-3p的表达水平,可以明显抑制胃癌细胞的增殖和迁移,而在MGC-803细胞中抑制miRNA-885-3p的表达,则能够显著促进胃癌细胞增殖、迁移和浸润.裸鼠皮下荷瘤实验和裸鼠体内的肺转移模型表明,高水平miR-885-3p可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移和浸润.第四,miRNA-885-3p靶基因确定.经过软件预测和细胞系水平的检测,进行了荧光素酶报告载体的构建.DLR实验表明miR-885-3p可以直接结合到CDK4基因的3-UTR区,经过构建不同结合位点的突变体,证实在3-UTR区的两个结合位点均在该调控中发挥作用.细胞和动物荷瘤组织样本的westenblotting实验也表明miR-885-3p可以调控CDK4蛋白水平,从而在转录后水平影响CDK4表达.第五,CDK4功能检测.鉴于近年来已有文献报道显示,CDK4作为细胞周期蛋白,其作用已经不仅仅在于改变细胞周期、影响肿瘤细胞增殖,也具备其他潜能,而对肿瘤细胞转移潜能的影响即为其中之一.因此,确认CDK4本身对于胃癌细胞恶性生物学行为的影响,将有助于判断miRNA-885-3p发挥抑癌潜能的原因所在.基于这些考虑,我们选择了两种细胞系,分别通过敲低和过表达CDK4的方式,检测其对胃癌细胞恶性行为的影响.实验结果显示,CDK4表达降低后,BGC-823细胞的增殖与浸润较对照组相比明显受到抑制,CDK4表达增强后,MGC-803细胞的增殖与浸润较对照组相比明显增强.这种作用与GCRL1的作用具有一致性,因此我们进一步探讨了GCRL1、miRNA-885-3p和CDK4三者在胃癌发生中的调控关系.第六,GCRL1-miRNA-885-3p-CDK4与胃癌恶性表型的调控及相关关系.体外和体内实验证实,GCRL1通过miR-885-3p调控CDK4表达,可以增强胃癌细胞的增殖从而促进胃癌的发生.通过对三者的表达水平进行相关性分析,发现GCRL1和CDK4在胃癌组织中的表达呈正相关,而miR-885-3p与CDK4的表达呈负相关关系.
结论芯片结果、胃癌及癌旁组织中表达水平检测均提示,lnc-RP11-290F20.3(Gastric Cancer Related LncRNA1, GCRL1)在细胞和组织明显增高.对GCRL1功能和机制的探究表明:第一,细胞水平的增殖实验、凋亡检测和侵袭实验表明,GCRL1能够显著促进胃癌细胞增殖、迁移和浸润,但对胃癌细胞凋亡的影响不明显.裸鼠皮下荷瘤实验和裸鼠体内的肺转移模型表明,抑制GCRL1可以抑制肿瘤在动物体内的生长和转移潜能.第二,利用生物信息学预测、在细胞和组织样本中进行靶miRNAs筛选、荧光素酶报告实验(DLR实验)及RNA富集实验表明,GCRL1可以靶向调控miR-885-3p的表达.第三,细胞增殖实验和transwell实验表明,miRNA-885-3p可以明显抑制胃癌细胞的增殖和迁移.裸鼠皮下荷瘤实验和裸鼠体内的肺转移模型表明,高水平miR-885-3p可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移和浸润.第四,经过软件预测和细胞系水平的检测、不同结合位点荧光素报告载体及突变体的构建、DLR实验表明miR-885-3p可以直接结合到CDK4基因的3-UTR区,且在3-UTR区的两个结合位点均在该调控中发挥作用.细胞和动物荷瘤组织样本的westenblotting实验也表明miR-885-3p可以调控CDK4蛋白水平,从而在转录后水平影响CDK4表达.第五,两种细胞系内,分别通过敲低和过表达CDK4的方式,检测其对胃癌细胞恶性行为的实验结果显示,CDK4高表达,不仅可以增强胃癌细胞的增殖能力,对细胞的浸润潜能也有增强,这种作用与GCRL1的作用具有一致性.第六,体外和体内实验证实,GCRL1通过miR-885-3p调控CDK4表达,可以增强胃癌细胞的增殖从而促进胃癌的发生.通过对三者的表达水平进行相关性分析,发现GCRL1和CDK4在胃癌组织中的表达呈正相关,而miR-885-3p与CDK4的表达呈负相关关系.综上所述,CDK4是miR-885-3p的靶基因之一,GCRL1通过miR-885-3p调控CDK4作为一个新的调控轴,可以促进胃癌细胞的增殖和转移从而促进胃癌的发生发展.
方法芯片检测表明,4000个以上lncRNAs在胃癌及癌旁组织中的表达水平相差悬殊.选取其中8个差异表达量最高的lncRNAs,通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测其在多种胃癌细胞系和多例组织样本中的表达水平,确定目标lncRNA.目标lncRNA对胃癌细胞恶性生物学行为的影响通过以下方法进行检测:MTT掺入和EdU摄入实验检测细胞增殖,AnnexinV-PI双染后通过流式细胞仪检测细胞apoptosis水平的变化,铺胶或者不铺胶的tranwell实验检测细胞迁移和侵袭,裸鼠皮下荷瘤及尾静脉注射建立肺部转移模型检测目标lncRNA对胃癌细胞BGC-823成瘤性及体内转移的影响.进而,生物信息学分析预测可能与该lncRNA发生相互作用的miRNAs.通过荧光素酶报告实验和RNA富集实验确定该lncRNA调控的miRNA.结合生物信息在线分析和预测的结果,我们对该miRNA可能发挥调控作用的靶蛋白进行表达分析、互补结合分析和相应的生物学行为检测.继而,在动物样本和临床样本中,均通过westernblotting实验、进一步的免疫组织化学染色(IHC)进行靶蛋白的表达水平验证.最后,结合GCRL1、miRNA和靶蛋白在胃癌临床样本中的表达水平、改变其水平后肿瘤细胞生物学行为变化、相互调控关系,进行三者之间的相关性分析.
结果根据芯片检测,胃癌及癌旁组织中4000个以上表达水平相差悬殊的lncRNAs,其中变化最显著的8个,通过qRT-PCR方法,我们使用了26对胃癌组织样本进行表达验证,也在多种不同的胃癌细胞系中进行了表达水平检测,其中,lnc-RP11-290F20.3在细胞和组织均趋于增高.lnc-RP11-290F20.3是长链非编码RNALINC01272的异构体之一,但目前尚没有lnc-RP11-290F20.3在疾病中作用和机制的研究报道.基于其在胃癌中的表达特点,我们选择lnc-RP11-290F20.3进行进一步研究,并将其命名为胃癌相关的lncRNA-1(Gastric Cancer Related LncRNA1, GCRL1).对GCRL1功能和机制的探究大致分为以下六个部分.第一,GCRL1对胃癌细胞恶性生物学行为的影响,包含在不同细胞系中,细胞水平的增殖实验、凋亡检测和侵袭实验,也包含增殖和转移能力相关的裸鼠体内实验.该细胞增殖实验和transwell实验表明,在BGC-823细胞中抑制GCRL1的表达,可以明显抑制胃癌细胞的增殖、迁移和浸润,而在MGC-803细胞中增强GCRL1的表达,则能够显著促进胃癌细胞增殖、迁移和浸润,但对胃癌细胞凋亡的影响均不明显.裸鼠皮下荷瘤实验和裸鼠体内的肺转移模型表明,抑制GCRL1可以抑制肿瘤在动物体内的生长和转移潜能.第二,利用生物信息学软件和网站对GCRL1调控的靶miRNAs进行预测,在细胞和组织样本中进行靶miRNAs筛选,并通过荧光素酶报告实验(DLR实验)及RNA富集实验进一步表明GCRL1可以靶向调控miR-885-3p的表达.第三,miR-885-3p本身在胃癌细胞中的功能检测.该部分也包含了在不同细胞系中的增殖实验、凋亡检测和侵袭实验,也包含增殖和转移能力相关的裸鼠体内实验.该细胞增殖实验和transwell实验表明,在BGC-823细胞中提高miRNA-885-3p的表达水平,可以明显抑制胃癌细胞的增殖和迁移,而在MGC-803细胞中抑制miRNA-885-3p的表达,则能够显著促进胃癌细胞增殖、迁移和浸润.裸鼠皮下荷瘤实验和裸鼠体内的肺转移模型表明,高水平miR-885-3p可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移和浸润.第四,miRNA-885-3p靶基因确定.经过软件预测和细胞系水平的检测,进行了荧光素酶报告载体的构建.DLR实验表明miR-885-3p可以直接结合到CDK4基因的3-UTR区,经过构建不同结合位点的突变体,证实在3-UTR区的两个结合位点均在该调控中发挥作用.细胞和动物荷瘤组织样本的westenblotting实验也表明miR-885-3p可以调控CDK4蛋白水平,从而在转录后水平影响CDK4表达.第五,CDK4功能检测.鉴于近年来已有文献报道显示,CDK4作为细胞周期蛋白,其作用已经不仅仅在于改变细胞周期、影响肿瘤细胞增殖,也具备其他潜能,而对肿瘤细胞转移潜能的影响即为其中之一.因此,确认CDK4本身对于胃癌细胞恶性生物学行为的影响,将有助于判断miRNA-885-3p发挥抑癌潜能的原因所在.基于这些考虑,我们选择了两种细胞系,分别通过敲低和过表达CDK4的方式,检测其对胃癌细胞恶性行为的影响.实验结果显示,CDK4表达降低后,BGC-823细胞的增殖与浸润较对照组相比明显受到抑制,CDK4表达增强后,MGC-803细胞的增殖与浸润较对照组相比明显增强.这种作用与GCRL1的作用具有一致性,因此我们进一步探讨了GCRL1、miRNA-885-3p和CDK4三者在胃癌发生中的调控关系.第六,GCRL1-miRNA-885-3p-CDK4与胃癌恶性表型的调控及相关关系.体外和体内实验证实,GCRL1通过miR-885-3p调控CDK4表达,可以增强胃癌细胞的增殖从而促进胃癌的发生.通过对三者的表达水平进行相关性分析,发现GCRL1和CDK4在胃癌组织中的表达呈正相关,而miR-885-3p与CDK4的表达呈负相关关系.
结论芯片结果、胃癌及癌旁组织中表达水平检测均提示,lnc-RP11-290F20.3(Gastric Cancer Related LncRNA1, GCRL1)在细胞和组织明显增高.对GCRL1功能和机制的探究表明:第一,细胞水平的增殖实验、凋亡检测和侵袭实验表明,GCRL1能够显著促进胃癌细胞增殖、迁移和浸润,但对胃癌细胞凋亡的影响不明显.裸鼠皮下荷瘤实验和裸鼠体内的肺转移模型表明,抑制GCRL1可以抑制肿瘤在动物体内的生长和转移潜能.第二,利用生物信息学预测、在细胞和组织样本中进行靶miRNAs筛选、荧光素酶报告实验(DLR实验)及RNA富集实验表明,GCRL1可以靶向调控miR-885-3p的表达.第三,细胞增殖实验和transwell实验表明,miRNA-885-3p可以明显抑制胃癌细胞的增殖和迁移.裸鼠皮下荷瘤实验和裸鼠体内的肺转移模型表明,高水平miR-885-3p可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移和浸润.第四,经过软件预测和细胞系水平的检测、不同结合位点荧光素报告载体及突变体的构建、DLR实验表明miR-885-3p可以直接结合到CDK4基因的3-UTR区,且在3-UTR区的两个结合位点均在该调控中发挥作用.细胞和动物荷瘤组织样本的westenblotting实验也表明miR-885-3p可以调控CDK4蛋白水平,从而在转录后水平影响CDK4表达.第五,两种细胞系内,分别通过敲低和过表达CDK4的方式,检测其对胃癌细胞恶性行为的实验结果显示,CDK4高表达,不仅可以增强胃癌细胞的增殖能力,对细胞的浸润潜能也有增强,这种作用与GCRL1的作用具有一致性.第六,体外和体内实验证实,GCRL1通过miR-885-3p调控CDK4表达,可以增强胃癌细胞的增殖从而促进胃癌的发生.通过对三者的表达水平进行相关性分析,发现GCRL1和CDK4在胃癌组织中的表达呈正相关,而miR-885-3p与CDK4的表达呈负相关关系.综上所述,CDK4是miR-885-3p的靶基因之一,GCRL1通过miR-885-3p调控CDK4作为一个新的调控轴,可以促进胃癌细胞的增殖和转移从而促进胃癌的发生发展.