【摘 要】
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目的探讨槲皮素诱导急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）细胞凋亡的分子机制,阐明血管内皮生长因子/蛋白激酶B（Vascular endothelial growth factor/protein kinase B,VEGF/AKT）通路在抗癌效应中的作用。方法⑴检测槲皮素对AML细胞增殖和凋亡的影响:碘化丙啶（Propidium iodide,PI）活染和乳酸脱氢酶
【基金项目】
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国家自然科学基金:mTORC1对溶酶体上V-ATPase结构以及功能的调节机理研究,项目合同编号:31601120,项目起止时间:2017.01-2019.12; 广西自然科学基金:以雷公藤红素为例探索开发中草药单体抗癌潜力的研究思路与方法,项目合同编号:2017GXNSFDA198020,项目起止时间:2017.11-2021.10
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目的探讨槲皮素诱导急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）细胞凋亡的分子机制,阐明血管内皮生长因子/蛋白激酶B（Vascular endothelial growth factor/protein kinase B,VEGF/AKT）通路在抗癌效应中的作用。方法⑴检测槲皮素对AML细胞增殖和凋亡的影响:碘化丙啶（Propidium iodide,PI）活染和乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）的释放检测细胞死亡情况;细胞增殖-毒性检测试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测细胞增殖能力;Hoechst 33258染色观察细胞死亡及核变化情况;蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白表达。⑵检测槲皮素对线粒体凋亡途径的作用:采用JC-1染色检测线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）的变化;蛋白印迹法检测细胞色素C及Bcl-2家族蛋白表达。⑶检测槲皮素对AML细胞凋亡上游信号通路的调节作用:运用等重同位素多标签相对定量蛋白质组学（i TRAQ）的方法,筛选槲皮素在AML细胞的作用靶点;酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测VEGF的分泌;蛋白免疫印迹法检测VEGF/AKT通路相关蛋白表达;流式细胞术检测细胞膜表面VEGFR2的表达;使用VEGF/AKT通路激活剂后,检测细胞死亡及线粒体膜电位。⑷检测槲皮素诱导的自噬:蛋白印迹法检测自噬及上游相关通路蛋白;Lyso Tracker Red检测溶酶体的活性;联合自噬抑制剂后检测细胞死亡。结果第一部分:槲皮素抑制AML细胞增殖并诱导凋亡（1）槲皮素能抑制AML细胞增殖,促进LDH的释放,诱导细胞死亡,且对细胞增殖有显著的抑制作用,呈浓度依赖性（P<0.01）;镜下观察可见细胞体积减小、Hoechst 33258染色显示核固缩和核碎裂等典型的凋亡特性。（2）槲皮素促进凋亡相关蛋白caspase 8、caspase 9、caspase 3的活化以及PARP的切割;联合凋亡抑制剂（caspase 8抑制剂Z-IETD-FMK、caspase 9抑制剂Z-LEHD-FMK和泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK）之后,Hoechst 33258染色可见核固缩和核碎裂等减少,LDH的释放和细胞死亡也减少（P<0.01）。第二部分:槲皮素激活了线粒体凋亡途径（1）槲皮素能够诱导JC-1染色红色/绿色荧光比值下降,呈浓度依赖性（P<0.01）;槲皮素处理后,细胞色素C在线粒体中表达减少,细胞质表达增多。（2）槲皮素能够诱导促凋亡蛋白表达上升,抗凋亡蛋白表达下降,这一系列蛋白改变呈时间和浓度依赖性。第三部分:槲皮素抑制了VEGF-VEGFR2-AKT通路（1）槲皮素处理后,AKT及其相关通路蛋白表达下降（P<0.05）,VEGF含量降低,且呈时间依赖性（P<0.01）,同时PI3K、AKT和VEGFR2蛋白的磷酸化水平表达下降;槲皮素处理后细胞膜表面VEGFR2表达下降,且呈时间依赖性（P<0.01）。提示槲皮素对VEGF-VEGFR2-AKT信号通路具有抑制作用。（2）槲皮素联合VEGF/AKT通路激活剂之后,与槲皮素单独处理组相比,细胞死亡减少（P<0.01）,线粒体膜电位升高（P<0.01）,p AKT表达上升,Bcl-2家族蛋白促凋亡蛋白表达不变,抗凋亡蛋白的表达上升,PARP切割减少,提示槲皮素对VEGF-VEGFR2-AKT通路的下调,对其诱导的细胞凋亡起着关键作用。第四部分:槲皮素诱导的自噬抑制AML细胞死亡（1）槲皮素处理组与对照组相比,LC3II、p62表达减少,m TOR下游蛋白磷酸化水平减少;槲皮素联合自噬抑制剂氯喹（Chloroquine,CQ）之后,与槲皮素单独处理组相比,LC3II、p62表达增加。自噬潮结果表明,槲皮素可在AML细胞上抑制m TOR信号通路,并诱导细胞自噬的发生。（2）槲皮素处理组与对照组相比,Lyso Tracker荧光强度增强,联合自噬抑制剂CQ处理后,荧光强度减弱,提示槲皮素可以激活溶酶体活性（p H降低）。（3）槲皮素联合自噬抑制剂与槲皮素单独处理组相比,细胞死亡增加（P<0.01）。结论1.槲皮素抑制AML细胞增殖并诱导caspase依赖的凋亡;2.槲皮素通过降低线粒体膜电位、并改变Bcl-2家族蛋白的表达、促进细胞色素C的释放,从而诱导AML细胞的线粒体凋亡;3.槲皮素抑制VEGF-VEGFR2-AKT通路,该通路对细胞凋亡起着关键作用;4.槲皮素诱导的自噬抑制AML细胞死亡。
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