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研究目的缺血性损伤是急性肾损伤的主要发病机制,而缺氧是缺血性损伤中最为关键的环节。肾组织氧分压低和肾小管上皮细胞耗能高,导致肾脏易受缺血/缺氧损伤。因此,肾脏缺血/缺氧在急性肾损伤发病和慢性肾脏病进展中都起相当重要的作用。低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF)作为氧自稳调节的关键性转录因子,能够调节百余种靶基因的表达,从而使得机体或细胞对缺血/缺氧性损伤产生适应性反应。目前发现HIF-α家族共有3个成员,包括HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α。既往研究已证实缺血/缺氧会诱导肾小管上皮细胞HIF-1α表达增加,并启动下游基因表达上调,从而产生保护作用,而有关HIF-2α在缺血/缺氧肾损伤中的作用尚未明确。本研究旨在通过体外研究明确HIF-2α在急性缺血/缺氧性肾损伤中的作用及其机制。材料和方法(1)样本处理：选取人近曲肾小管上皮细胞株(HK-2)作为实验细胞。采用氯化钴(cobalt dichloride,CoCl2)诱导化学低氧建立细胞低氧模型。借鉴我实验室既往建立的细胞体外低氧模型,即在细胞培养液中加入150μmol/LCoCl2培养HK-2细胞。收集低氧0、6、12、24、48和52h的HK-2细胞并提取细胞总蛋白,采用Western blot免疫印记定量法检测不同时间段CoCl2低氧培养后HK-2细胞中HIF-2α的蛋白表达量。(2)HIF-2α干扰：HIF-2αsiRNA与阴性对照试剂由上海吉玛公司设计并合成,转染试剂选择美国Dharmacon公司的DharmaFECT 1转染试剂。根据公司提供的转染方法进行操作。借鉴我实验室既往在体外HIF-lαsiRNA干扰实验方面的经验,选用终浓度为100nmol/L的HIF-2αsiRNA沉默HK-2细胞的HIF-2α。细胞分为五组：第一组细胞不经过RNAi和低氧培养,即正常培养组(N组)；第二组细胞不经过RNAi,仅有低氧处理,即低氧培养组(H组)；第三组细胞在RNAi时仅加入转染试剂,并经过低氧处理,即转染试剂组(T组)；第四组细胞在RNAi时应用一个无任何靶基因的siRNA阴性对照,并经过低氧处理,即阴性对照组(NC组)；第五组细胞经过HIF-2αsiRNA作用,并经过低氧处理,即HIF-2αsiRNA组(HR组)。处理48h后收集细胞蛋白样本并检测各组细胞中HIF-2α蛋白表达量。另外,转染HIF-2αsiRNA和转染阴性对照试剂的HK-2细胞,分别经过氯化钴化学低氧处理48h后,应用荧光定量PCR法检测细胞中HIF-2αmRNA的表达量。从而建立HIF-2αsiRNA模型。(3)将HK-2细胞分为上述五组,应用流式细胞术(Annexin/PI双染法)检测细胞的凋亡情况,应用乳酸脱氢酶(LDH)检测法检测细胞坏死情况。(4)用Western blot免疫印记定量法检测上述五组(N组、H组、T组、NC组、HR组)细胞低氧48h后HIF-2α与VEGF蛋白的表达量。收集150μmol/LCoCl2低氧培养6、12、24、48和52h后的细胞并提取细胞总蛋白,采用Western blot免疫印记定量法检测不同时间段CoCl2低氧培养后HK-2细胞中HIF-2α、VEGF的蛋白表达量,从而明确HIF-2α与VEGF的关系。用Western blot免疫印记定量法检测48hH组(低氧48h)、24hH组(低氧24h)、以及N组、NC组、HR组细胞低氧48h后HIF-2α与Glut-1蛋白的表达量,从而明确HIF-2α与Glut-1的关系。结果(1)HIF-2α时序表达：COCl2化学低氧24h、48h、52h后均有HIF-2α蛋白的表达上调,48h后HIF-2α达到峰值,且蛋白水平显著高于24h与52h(P<0.01),低氧24h与52h后HIF-2α蛋白表达差异无统计学意义。(2)HIF-2αsiRNA干扰：siRNA的细胞转染效率为95%～100%。HR组HIF-2α蛋白的表达显著低于H组、T组、NC组(P<0.01),但与N组相比,差异无统计学意义；H组、T组、NC组HIF-2α蛋白的表达显著高于N组(P<0.01)；H组、T组、NC组之间HIF-2α蛋白的表达差异无统计学意义。HIF-2αsiRNA组HIF-2αmRNA的表达显著低于阴性对照组(P<0.05),HIF-2αsiRNA沉默HIF一2αmRNA的效率可达到88.0%。(3)细胞凋亡坏死情况：N组、H组、T组、NC组、HR组细胞的凋亡率依次为2.45±0.39%、4.81±0.72%、5.82±0.54%、5.72±0.74%、7.95±0.40%,HR组细胞的凋亡率显著高于其他四组(P<0.01),N组细胞的凋亡率显著低于其他四组(P<0.01)；N组、H组、T组、NC组、HR组细胞培养液中LDH活性依次为492.6±49.OU/L.687.1±55.4U/L662.6±16.8U/L、638.7±46.3U/L和1330.7±26.1U/L,HR组细胞培养液中LDH活性显著高于其他四组(P<0.01),而N组细胞培养液中LDH活性则显著低于其他四组(P<0.01)。(4)HIF-2α与VEGF的关系：HR组VEGF蛋白的表达显著低于H组、T组、NC组(P<0.01),但与N组相比,差异无统计学意义；H组、T组、NC组VEGF蛋白的表达显著高于N组(P<0.01)；H组、T组、NC组之间VEGF蛋白的表达差异无统计学意义。VEGF蛋白的表达随低氧时间的延长表达逐步升高,且低氧48h后VEGF表达最高,低氧52h后VEGF表达下降,低氧48h后VEGF表达量显著高于24h与52h(P<0.01)。VEGF蛋白的表达与HIF-2α蛋白的表达一致。(5)HIF-2α与Glut-1的关系：48hH、NC组Glut-1蛋白的表达显著高于HR组、24hH组和N组(P<0.05)；HR组、24hH组和N组之间Glut-1蛋白的表达差异无统计学意义。Glut-1蛋白的表达与HIF-2α蛋白的表达一致。结论(1)HK-2细胞CoCl2化学低氧24h、48h、52h后均有HIF-2α蛋白的表达,低氧48h后HIF-2α表达达高峰,随后表达下降。(2)对于HK-2细胞,转染试剂与siRNA以(4μl：0.2nmol)比例混合、siRNA终浓度为100nmol/L时,可以获得较高的转染效率和HIF-2α沉默效率(3)CoCl2化学低氧会引起HK-2细胞的凋亡与坏死,沉默HIF-2α基因后将显著加重HK-2细胞的凋亡与坏死,因此低氧状态下HIF-2α蛋白的表达可以减轻HK-2细胞的凋亡与坏死。(4)VEGF蛋白与HIF-2α蛋白时序表达一致,都于低氧48h后表达达高峰；沉默HIF-2旺基因后HIF-2α蛋白与VEGF蛋白的表达均下降。因此低氧后HIF-2α通过调节VEGF的表达产生相应的作用。(5)HK-2细胞低氧48h后HIF-2α与Glut-1蛋白表达上调,沉默HIF-2α基因后HIF-2α与Glut-1蛋白表达均下调。因此低氧后HIF-2α通过调节Glut-1产生相应的作用。