研究背景及目的术后神经认知障碍（postoperative neurocognitive disorder,PND）通常表现为手术麻醉后出现的意识、定向功能、记忆、认知及睡眠等方面的紊乱,其发病率为10%-54%。术后神经认知障碍对人体具有长期影响,包括术后功能恢复不全、死亡率的增加、住院时间延长、长期认知能力下降及痴呆等。虽然目前针对术后神经认知障碍的具体病理生理性机制还不完全清楚,但是越来越多的证据表明神经炎症在其发生发展过程中的关键作用。因此,深入研究术后神经认知障碍的机制对其潜在干预及治疗靶点具有重要意义。乙酸盐（Acetate）属于短链脂肪酸（short-chain fatty acids,SCFAs）,主要来源于肠道微生物对膳食纤维的发酵作用,是人体重要的代谢产物。乙酸盐可作为细胞能量的来源,对能量供应、脂肪酸合成和脂质代谢起着关键作用;同时乙酸盐具有调控免疫反应及炎症反应等功能。但是,其在术后神经认知障碍中的作用还未见相关报道。本研究旨在初步探索乙酸盐在术后神经认知障碍中的作用,以及对小胶质细胞介导的中枢炎症反应的调控作用及其可能的机制,为术后神经认知障碍的干预与治疗提供潜在的研究方向。研究方法1.建立术后神经认知障碍模型并检测海马组织促炎细胞因子的表达（1）构建老年小鼠术后神经认知障碍模型:取12月雄性C57BL/6老年小鼠,将其随机分为对照组及手术组,使用异氟醚麻醉下剖腹探查术构建老年小鼠术后神经认知障碍模型。（2）行为学实验:术前连续5天对老年小鼠进行水迷宫（morris water maze,MWM）训练,使所有小鼠均学会寻找隐蔽平台并排除术前已知的认知功能缺陷;于术后第3天通过旷场实验（open field test,OFT）检测小鼠的自发活动能力,以排除手术对小鼠运动功能的影响;于术后第3天及第7天进行水迷宫测试,观察老年小鼠神经认知功能的改变。（3）海马促炎细胞因子的表达:分别于术后第1天及第7天获取小鼠海马组织,通过ELISA检测炎性因子TNF-α、IL-6及IL-1β的表达。2.外源性乙酸盐在术后神经认知障碍及中枢炎症中的作用（1）乙酸盐对老年小鼠术后神经认知功能的改善作用:将老年小鼠随机分为4组:对照组、乙酸盐组、手术组及乙酸盐干预组。在构建老年小鼠术后神经认知障碍模型前对其进行连续5天的水迷宫训练。手术组及乙酸盐干预组小鼠行异氟醚麻醉下剖腹探查术;乙酸盐及乙酸盐干预组小鼠给予含乙酸盐饮用水,浓度为200 m M,术前连续7天自由饮用。术后第3天进行旷场实验,术后第3、7天进行水迷宫测试,记录相关数据。（2）乙酸盐对外周及海马炎症反应的作用:老年小鼠建模6小时后,收集小鼠外周血并检测小鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平;分别于建模6小时、术后第1天及术后第7天,取小鼠海马组织并检测促炎细胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β水平。（3）乙酸盐对老年小鼠海马组织炎症信号通路的影响:分别于建模6小时、术后第1天及术后第7天,取小鼠海马组织并使用Western Blot检测炎症信号通路NF-κB、p38 MAPK的表达。（4）乙酸盐对小鼠海马组织氧化应激反应的影响:分别于建模后第1天及第7天,获取小鼠海马组织并使用Western Blot检测氧化应激分子NADPH氧化酶2（Nox-2）及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的水平;同时通过免疫荧光检测海马组织8羟基脱氧鸟苷（8-OH-d G）的表达。（5）外源性乙酸盐对小胶质细胞活化的影响:分别于建模后第1天及第7天,获取老年小鼠海马组织并使用免疫荧光检测CA1区小胶质细胞激活标志物IBA-1的表达。3.外源性乙酸盐对体外BV2小胶质细胞炎症反应的作用（1）不同浓度乙酸盐在不同时间点对BV2小胶质细胞炎症反应的影响:将BV2细胞分为:对照组、LPS组及不同浓度乙酸盐干预组（10 m M、20 m M及50 m M）。乙酸盐分别于LPS刺激前30分钟或LPS刺激后30分钟加入。待LPS（100 ng/ml）作用时间达6小时后,收集细胞上清检测炎性因子TNF-α、IL-6表达。（2）不同浓度乙酸盐对BV2细胞活力的影响:将BV2细胞分为对照组及LPS组。向两组细胞各自加入不同浓度乙酸盐（0 m M、10 m M、20 m M及50 m M）,LPS（100 ng/ml）刺激6小时后,通过MTT方法检测细胞活力。（3）乙酸盐对BV2小胶质细胞炎性信号通路的影响:将BV2细胞分为下列4组:对照组、乙酸盐组、LPS组及乙酸盐干预组。LPS（100 ng/ml）刺激30分钟后,加入乙酸盐（20 m M）,待LPS作用6小时后,收集细胞检测NF-κB、p38 MAPK的表达。（4）乙酸盐对BV2小胶质细胞氧化应激反应的影响:培养BV2细胞,将其分为上述4组。LPS（100 ng/ml）刺激30分钟后,加入乙酸盐（20 m M）,待LPS作用6小时后,收集细胞检测氧化应激因子NADPH氧化酶2（Nox-2）及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的水平。4.乙酸盐调控炎症反应的初步机制探索（1）体外培养BV2细胞,使用小干扰RNA敲低BV2细胞G蛋白偶联受体GPR41及GPR43的表达。干扰48小时后,给予相应的LPS（100 ng/ml）及乙酸盐（20 m M）刺激,LPS作用6小时后收集细胞上清检测TNF-α、IL-6水平;同时,干扰完成后,收集底部细胞测定GPR41及GPR43的m RNA水平。（2）培养BV2细胞,使用si-RNA干扰G_qα亚基48小时,而后给予LPS（100ng/ml）及乙酸盐（20 m M）刺激,LPS作用6小时后收集细胞上清检测TNF-α、IL-6水平;同时,敲低BV2细胞G_qα亚基后,检测BV2细胞G_qα的m RNA表达。另外,使用G_i/oα亚基抑制剂百日咳毒素（PTX,50 ng/ml）,30分钟后给予LPS（100 ng/ml）及乙酸盐（20 m M）刺激,LPS作用6小时后收集细胞上清检测TNF-α、IL-6表达。研究结果1.PND建模后,老年小鼠出现神经认知功能改变并伴随海马组织炎症反应（1）两组老年小鼠在术前连续5天的水迷宫训练中均能找到隐蔽平台,两组小鼠的潜伏期（latency）及平均速度无明显差异。术后第3天,旷场实验显示两组老年小鼠的总活动距离及静止时间均无明显差异。在空间探索测试阶段,术后第3天,手术组小鼠的穿台次数显著低于对照组,而目标象限时间和路程百分比与对照组相比则无明显差异;术后第7天,与对照组相比,手术组小鼠穿台次数、目标象限时间百分比及路程百分比显著降低。（2）术后第1天,手术刺激可诱导海马组织炎性因子TNF-α、IL-6及IL-1β的高表达;术后第7天,手术组小鼠海马组织IL-1β的水平仍显著高于对照组,而TNF-α与IL-6的水平相较对照组无明显差异。2.乙酸盐可部分改善PND老年小鼠认知功能并减轻海马组织炎症反应及氧化应激反应（1）四组老年小鼠在术前连续5天的水迷宫训练中均能找到隐蔽平台,四组小鼠训练潜伏期（latency）与平均速度无明显差异。术后第3天,旷场实验示各组老年小鼠的总活动距离及静止时间均无显著差异。外源性补充乙酸盐可改善老年小鼠术后神经认知功能,表现为术后第3天及第7天乙酸盐干预组小鼠穿台次数、目标象限时间百分比、路程百分比都显著高于手术组。（2）体外补充乙酸盐可降低急性期外周及中枢炎症因子（TNF-α、IL-6及IL-1β）水平,抑制术后6小时及术后第1天手术刺激诱导的海马炎性通路（NF-κB/p38MAPK）表达,同时降低术后氧化应激因子（Nox-2、iNOS、8-OH-d G）水平;另外,乙酸盐能抑制海马组织小胶质细胞激活标志物IBA-1的表达。3.乙酸盐可抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症反应及氧化应激反应体外补充乙酸盐可有效降低LPS诱导的BV2小胶质细胞中TNF-α及IL-6水平;同时乙酸盐能有效降低LPS刺激后BV2小胶质细胞炎症信号通路（NF-κB/p38MAPK）及氧化应激因子（Nox-2、iNOS）的表达。4.乙酸盐通过激动GPR43-G_qα信号发挥抗炎作用（1）使用小干扰RNA干扰BV2小胶质细胞表面短链脂肪酸受体GPR41及GPR43的基因表达,当敲低BV2细胞短链脂肪酸受体GPR41后,乙酸盐能降低LPS诱导的TNF-α与IL-6的水平;当敲低BV2细胞短链脂肪酸受体GPR43后,乙酸盐则不能发挥上述抑炎作用。（2）使用小干扰RNA敲低BV2细胞G_qα亚基的表达,乙酸盐不能显著降低LPS刺激后细胞上清中TNF-α与IL-6的水平;而给予G_i/oα亚基抑制剂PTX后,体外补充乙酸盐仍可有效抑制BV2小胶质细胞中LPS诱导的上诉炎性因子表达。研究结论补充短链脂肪酸乙酸盐可有效抑制老年小鼠海马小胶质细胞激活,降低海马炎症反应及氧化应激反应,从而改善术后神经认知功能;体外补充乙酸盐可显著降低LPS刺激下BV2小胶质细胞中TNF-α、IL-6水平,抑制炎症信号NF-κB及p38 MAPK的表达,同时降低氧化应激因子Nox-2及iNOS的水平。结果提示乙酸盐可能主要通过激动GPR43-G_qα信号调节小胶质细胞活性,进而抑制NF-κB及p38 MAPK信号通路的激活。